Moleculair genetische methoden
DNA-technologiemethoden worden gebruikt om de lokalisatie te bepalen in een bepaald chromosoom van een mutant gen dat verantwoordelijk is voor de oorsprong van bepaalde vormen van erfelijke pathologie. Aangezien het gen is een DNA-segment en genmutatie - beschadiging van de primaire structuur van DNA( een mutatie wordt verstaan alle wijzigingen in de DNA-sequentie, ongeacht hun locatie en de invloed op de individuele levensvatbaarheid) dan sonderen preparaten van metafase patient chromosomen erfelijke ziekte, kan worden vastgesteldlokalisatie van pathologisch gen. Methoden van moleculaire genetica creëren kansen voor het diagnosticeren van ziekten op het niveau van de veranderde DNA-structuur, ze laten toe om de lokalisatie van erfelijke aandoeningen te achterhalen. Moleculair genetische methoden kunnen mutaties onthullen die gepaard gaan met de vervanging van zelfs een enkele base.
De belangrijkste fase van genidentificatie is de isolatie. DNA kan worden geïsoleerd van elk type weefsel en celbevattende kernen. De stappen van DNA-isolatie omvatten snelle lysis van de cellen door centrifugeren onder verwijdering van fragmenten van cellulaire organellen en membranen, enzymatische afbraak van eiwitten en hun extractie uit de oplossing met fenol en chloroform, DNA-concentratie door precipitatie in ethanol.
genetische laboratoria vaak DNA geïsoleerd uit leukocyten, waarvoor de patiënt 5-20 ml veneus bloed afgenomen in een steriele buis met een oplossing van een antistollingsmiddel( heparine).Leukocyten worden vervolgens gescheiden en verwerkt volgens de hierboven geschetste stappen.
volgende fase van de voorbereiding van het materiaal aan het onderzoek - DNA "cut" in fragmenten in inrichtingen met uitsluitend specifieke basensequentie wordt uitgevoerd door bacteriële enzymen - restrictie-endonucleasen( restrictie-enzymen).Restrictie-enzymen herkennen specifieke sequenties van 4-6, ten minste 8-12 nucleotiden in dubbelstrengs DNA molecuul en zijn verdeeld in fragmenten van deze sequenties lokaliseren gebieden genoemd restrictieplaatsen. Nummer restrictiefragmenten van DNA wordt bepaald door de frequentie van restrictieplaatsen en fragmenten van grootte - de aard van de verdeling van deze plaatsen langs de lengte van de originele DNA-molecule. Hoe vaker de restrictieplaatsen zich bevinden, hoe korter de DNA-fragmenten na beperking. Momenteel zijn meer dan 500 verschillende soorten restrictie-enzymen van bacteriële oorsprong bekend, en elk van deze enzymen herkent de specifieke sequentie van nucleotiden ervan. In de toekomst kunnen restrictiesites worden gebruikt als genetische markers voor DNA.Het resulterende DNA restrictiefragmenten kunnen worden gesorteerd op lengte door elektroforese in agarose of polyacrylamide gels en kunnen dus worden bepaald molecuulgewicht ervan. Meestal voor de detectie van DNA in de gel die door specifieke kleuring( meestal ethidiumbromide) en die de gel in doorvallend licht van de ultraviolette. Locaties van DNA-lokalisatie hebben een rode kleur. Echter iemand bij het verwerken van verschillende DNA restrictie-endonucleasen gevormd zoveel fragmenten van verschillende lengtes die ze niet worden gescheiden door elektroforese, is het onmogelijk om visueel de afzonderlijke DNA-fragmenten te identificeren elektrofore gram( geproduceerd uniforme kleuring gehele lengte van de gel).Daarom wordt een hybridisatiemethode met gelabelde DNA-probes gebruikt om de gewenste DNA-fragmenten in een dergelijke gel te identificeren.
Elk segment van enkelstrengs DNA of RNA kan( hybridiseren) te binden met zijn complementaire keten met guanine altijd gepaard met cytosine, adenine met thymine. Dit is de vorming van een dubbelstrengs molecuul. Als een enkelstrengige kopie van het gekloonde gen is gelabeld met een radioactief label, zal een probe worden verkregen. De sonde is in staat om een complementair DNA-segment te vinden dat vervolgens gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door radioautografie. De radioactieve probe wordt toegevoegd aan het geneesmiddel gestrekt chromosomen mogelijk maakt om het gen te lokaliseren op een bepaald chromosoom met een DNA-probe kan bepaalde delen identificeren in een Southern blot. Hybridisatie treedt op als het testgedeelte van het DNA een normaal gen bevat. In de gevallen waarin een abnormale sequentie van nucleotiden, dat wil zeggen de overeenkomstige chromosoomstructuren bevatten mutant gen hybridisatie zal optreden, waardoor de lokalisatie van het afwijkende gen te bepalen.
Om DNA-probes te verkrijgen, wordt de methode voor het klonen van genen gebruikt. De essentie van de werkwijze is, dat het DNA-fragment dat overeenkomt met elk gen of gebied van het gen ingevoegd in de klonering deeltje, gewoonlijk een bacterieel plasmide( circulair extrachromosomaal DNA dat in bacteriële cellen en uitvoeren resistentiegenen tegen antibiotica), en vervolgens de bacteriëneen plasmide hebben met een ingebouwde menselijke
-gen, vermenigvuldigen. Dankzij de syntheseprocessen in het plasmide is het mogelijk miljarden kopieën van het menselijke gen of de plaats ervan te verkrijgen.
Verdere kopieën van DNA gelabeld met een radioactief label of fluorochromen worden als probes gebruikt om te zoeken naar complementaire sequenties uit de pool van bestudeerde DNA-moleculen.
Momenteel zijn er vele variëteiten van werkwijzen die DNA-probes gebruiken voor de diagnose van genmutaties.