Molekulární genetické metody
metody DNA technologie se používají k určení lokalizace v určitém chromosomu mutantní gen zodpovědný za vznik určitých forem dědičných chorob. Vzhledem k tomu, gen je segment DNA a mutace genu - poškození primární struktury DNA( mutace se rozumí všechny změny v sekvenci DNA, bez ohledu na jejich umístění a vlivu na jednotlivé životaschopnost), pak sondáž přípravky chromosomů v metafázi pacientů dědičné onemocnění, možné stanovitlokalizace patologického genu. Metody molekulární genetiky vytvořit možnost diagnostiku onemocnění, při změněné struktury DNA, které umožňují zjistit lokalizaci dědičných poruch. Molekulárně genetické metody mohou detekovat mutace spojené s výměnou i jediné báze.
Nejdůležitějším stupněm identifikace genů je jejich izolace. DNA může být izolována z jakéhokoliv typu jádra a buněk obsahujících jádra. Kroky izolaci DNA zahrnují rychlé lýze buněk odstřeďováním s odstraněním fragmenty buněčných organel a membrán, enzymatickou destrukci proteinů a jejich extrakce z roztoku s fenolem a chloroformem, koncentrace DNA vysrážením v ethanolu.
v genetických laboratořích často DNA izolovaná z leukocytů, pro které je pacient odebraných 5-20 ml žilní krev do sterilní zkumavky s roztokem antikoagulantu( heparin).Leukocyty se pak oddělí a zpracují podle kroků uvedených výše.
další etapa přípravy materiálu ke studiu - DNA „cut“ na fragmenty na místech s přísně specifickou sekvencí bází se provádí pomocí bakteriálních enzymů - restrikčních endonukleáz( restrikčních enzymů).Restrikční enzymy rozeznávají specifické sekvence 4-6, alespoň 8-12 nukleotidů do molekuly dvouřetězcové DNA a jeho rozdělit na fragmenty těchto sekvencí lokalizaci míst nazývají restrikční místa. Počet produkoval restrikční fragmenty DNA určena frekvencí výskytu restrikčních míst a fragmenty o velikosti - povaze rozložení těchto míst podél délky původní molekuly DNA.Čím častěji se nacházejí restrikční místa, tím kratší jsou fragmenty DNA po omezení.V současné době existuje více než 500 různých typů restrikčními enzymy bakteriálního původu, a každý z těchto enzymů uznává svou specifickou sekvenci nukleotidů.V budoucnu mohou být restrikční místa použity jako genetické markery DNA.Vzniklé restrikční fragmenty DNA lze třídit podle délky elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, a tak může být určena jejich molekulové hmotnosti. Obvykle se pro detekci DNA v gelu používaného specifického barvení( obvykle ethidiumbromidem) a zobrazení gelu v procházejícím světle ultrafialové.Lokalizace lokalizace DNA mají červenou barvu. Naproti tomu se při zpracování několika DNA restrikční endonukleázy vytvořeny tak mnoho fragmenty různé délky, které se nedaří být odděleny elektroforézou, že není možné vizuálně identifikovat jednotlivé fragmenty DNA se elektrofore-gram( produkovaný rovnoměrné zabarvení po celé délce gelu).Proto, aby se identifikovat příslušné fragmenty DNA v gelu s použitím hybridizace se značenými DNA sond.
Každý segment jednořetězcové DNA nebo RNA je schopen vázat( hybridizaci) s komplementárním řetězcem, s guanin je vždy spojena s cytosin, adenin s thyminu. Toto je tvorba dvojvláknové molekuly. Pokud se jednovláknové kopie klonovaného genu označit radioaktivní značku, sondu. Sonda schopná získat komplementární DNA segment, který je pak snadno identifikovat autoradiografií.Radioaktivní sondy se přidá do chromozomů drog protáhl umožňuje lokalizovat gen pro konkrétní chromozomu s DNA sondou lze identifikovat určité části v Southern blotu. Hybridizace nastane, pokud testovací část DNA obsahuje normální gen. V případě, že existuje abnormální sekvence nukleotidů, tj. Odpovídající chromozomů struktury obsahují mutantní gen, nedojde hybridizace, který umožňuje určit lokalizaci abnormálního genu.
Pro DNA sond metodou klonování genu. Podstata metody spočívá v tom, že fragment DNA odpovídající každý gen nebo oblasti genu vloženého do klonovacího částice, obvykle bakteriální plasmid( kruhové extrachromozomální DNA přítomné v bakteriálních buňkách a nesoucí geny rezistence na antibiotika), a pak se bakteriekterý má plazmid s vestavěným lidským
gen, násobit. Díky syntézním procesům v plazmidu je možné získat miliardy kopií lidského genu nebo jeho místa.
Další kopie DNA značené radioaktivním štítkem nebo fluorochromy se používají jako sondy pro hledání komplementárních sekvencí mezi skupinou studovaných molekul DNA.
V současnosti existuje mnoho druhů metod, které používají DNA sondy pro diagnostiku genových mutací.