Molekulárne genetické metódy
metódy DNA technológie sa používajú na určenie lokalizácie v určitom chromozóme mutantný gén zodpovedný za vznik určitých foriem dedičných chorôb. Vzhľadom k tomu, gén je segment DNA a mutácie génu - poškodenie primárnej štruktúry DNA( mutácie sa rozumie všetky zmeny v sekvencii DNA, bez ohľadu na ich umiestnenie a vplyvu na jednotlivé životaschopnosť), potom sondáž prípravky chromozómov v metafáze pacientov dedičné ochorenie, možné stanoviťlokalizácia patologického génu. Metódy molekulárnej genetiky vytvoriť možnosť diagnostiku ochorení, pri zmenenej štruktúry DNA, ktoré umožňujú zistiť lokalizáciu dedičných porúch. Molekulárne genetické metódy môžu odhaliť mutácie spojené s nahradením dokonca jednej bázy.
Najdôležitejšou etapou identifikácie génov je ich izolácia. DNA môže byť izolovaná z akéhokoľvek typu tkaniva a buniek obsahujúcich jadrá.Kroky izoláciu DNA zahŕňajú rýchle lýze buniek odstreďovaním s odstránením fragmenty bunkových organel a membrán, enzymatickou deštrukcii proteínov a ich extrakciu rozpúšťadlom s fenolom a chloroformom, koncentrácia DNA vyzrážaním v etanole.
v genetických laboratóriách často DNA izolovaná z leukocytov, pre ktoré je pacient odobratých 5-20 ml žilovej krv do sterilnej skúmavky s roztokom antikoagulantu( heparín).Leukocyty sa potom separujú a spracujú podľa krokov uvedených vyššie.
ďalšia etapa prípravy materiálu na štúdium - DNA "cut" na fragmenty na miestach s prísne špecifickou sekvenciou bázou sa vykonáva pomocou bakteriálnych enzýmov - restrikčná endonukleáza( reštrikčných enzýmov).Reštrikčné enzýmy rozoznávajú špecifické sekvencie 4-6, aspoň 8-12 nukleotidov do molekuly dvouřetězcové DNA a jeho rozdeliť na fragmenty týchto sekvencií lokalizáciu miest nazývajú reštrikčné miesta. Počet produkoval reštrikčné fragmenty DNA určená frekvenciou výskytu reštrikčných miest a fragmenty o veľkosti - povahe rozloženie týchto miest pozdĺž dĺžky pôvodnej molekuly DNA.Čím častejšie sú umiestnené restrikčné miesta, tým kratšie sú fragmenty DNA po obmedzení.V súčasnej dobe existuje viac ako 500 rôznych typov reštrikčnými enzýmami bakteriálneho pôvodu, a každý z týchto enzýmov uznáva svoju špecifickú sekvenciu nukleotidov. V budúcnosti sa môžu ako genetické markery pre DNA použiť restrikčné miesta. Vzniknuté reštrikčné fragmenty DNA je možné triediť podľa dĺžky elektroforézy na agarózovom alebo polyakrylamidovom gélu, a tak môže byť určená ich molekulovej hmotnosti. Zvyčajne sa pre detekciu DNA v géle používaného špecifického farbenie( zvyčajne etidiumbromidom) a zobrazenie gélu v prechádzajúcom svetle ultrafialové.Lokalizácia lokalizácie DNA má červenú farbu. Naproti tomu sa pri spracovaní niekoľkých DNA reštrikčné endonukleázy vytvorené tak veľa fragmenty rôznej dĺžky, ktoré sa nedarí byť oddelené elektroforézou, že nie je možné vizuálne identifikovať jednotlivé fragmenty DNA sa elektrofore-gram( produkovaný rovnomerné zafarbenie po celej dĺžke gélu).Preto, aby sa identifikovať príslušné fragmenty DNA v géle s použitím hybridizácie sa značenými DNA sond.
Každý segment jednoreťazcová DNA alebo RNA je schopný viazať( hybridizácii) s komplementárnym reťazcom, s guanín je vždy spojená s cytozín, adenín s tymínu. Toto je tvorba dvojvláknovej molekuly. Ak sa jednovláknové kópie klonovaného génu označiť rádioaktívne značku, sondu. Sonda schopná získať komplementárne DNA segment, ktorý je potom ľahko identifikovať autorádiografiou. Rádioaktívne sondy sa pridá do chromozómov drog pretiahol umožňuje lokalizovať gén pre konkrétnu chromozómu s DNA sondou možno identifikovať určité časti v Southern Blot. Hybridizácia nastane, ak testovaná časť DNA obsahuje normálny gén. V prípade, že existuje abnormálne sekvencie nukleotidov, tj. Zodpovedajúce chromozómov štruktúry obsahujú mutantný gén, nedôjde hybridizácia, ktorý umožňuje určiť lokalizáciu abnormálneho génu.
Pre DNA sond metódou klonovania génu. Princíp spočíva v tom, že fragment DNA zodpovedajúce každý gén alebo oblasti génu vloženého do klonovacieho častice, zvyčajne bakteriálne plazmid( kruhové extrachromozomální DNA prítomné v bakteriálnych bunkách a nesúci gény rezistencie na antibiotiká), a potom sa baktériektorý má plazmid so zabudovaným ľudským
Gén, vynásobte. Vďaka procesom syntézy v plazmide je možné získať miliardy kópií ľudského génu alebo jeho miesta.
Ďalšie kópie DNA označenej rádioaktívnou značkou alebo fluorochrómami sa používajú ako sondy na vyhľadávanie komplementárnych sekvencií medzi skupinami študovaných molekúl DNA.
V súčasnosti existuje veľa druhov metód používajúcich sondy DNA na diagnostiku génových mutácií.