Molekylärgenetiska metoder
DNA-teknologimetoder används för att bestämma lokalisering i en speciell kromosom av den mutanta genen ansvarig för ursprunget för vissa former av ärftliga sjukdomar. Eftersom genen är ett DNA-segment och genmutation - skada på den primära strukturen av DNA( en mutation förstås av alla förändringar i DNA-sekvensen, oavsett deras läge och påverkan på den enskilda viabilitet) därefter sondering beredningar av metafas patientens kromosomer ärftlig sjukdom, möjligt att fastställalokalisering av patologisk gen. Metoder för molekylär genetik skapar möjligheter att diagnostisera sjukdomar i nivå med den förändrade DNA-strukturen, de tillåter att ta reda på lokalisering av ärftliga störningar. Molekylärgenetiska metoder kan avslöja mutationer i samband med utbyte av till och med en enda bas.
Det viktigaste steget i genidentifiering är dess isolering. DNA kan isoleras från vilken typ av vävnad och cell som innehåller kärnor. Stegen av DNA-isolering inkluderar snabb lys av cellerna genom centrifugering med avlägsnande av fragment av cellulära organeller och membran, enzymatisk nedbrytning av proteiner och deras utvinning från lösningen med fenol och kloroform, DNA-koncentrationen genom utfällning i etanol.
i genetiska laboratorier ofta DNA isolerat från leukocyter, för vilka patienten är tagna 5-20 ml venöst blod i ett sterilt rör med en lösning av ett antikoaguleringsmedel( heparin).Leukocyter separeras sedan och bearbetas enligt stegen beskrivna ovan.
nästa steg i framställningen av materialet till studiet - DNA "cut" till fragment på platser med strikt specifik bassekvens utförs med hjälp av bakteriella enzymer - restriktionsendonukleaser( restriktionsenzymer).Restriktionsenzymer känner igen specifika sekvenser av 4-6, minst 8-12 nukleotider i dubbelsträngad DNA-molekyl och dess separeras till fragment av dessa sekvenser lokalisera centra kallade restriktionsställen. Siffer producerade restriktionsfragment av DNA som bestäms av frekvensen av förekomsten av restriktionsställen och fragment av storlek - arten av fördelningen av dessa platser längs längden av den ursprungliga DNA-molekylen. Ju oftare restriktionsställena är placerade desto kortare DNA-fragment efter restriktion. För närvarande är mer än 500 olika typer av restriktionsenzymer av bakteriellt ursprung kända, och var och en av dessa enzymer känner igen sin specifika sekvens av nukleotider. I framtiden kan restriktionsställen användas som genetiska markörer för DNA.De resulterande DNA-restriktionsfragment kan sorteras efter längd med elektrofores i agaros eller polyakrylamidgeler, och sålunda kan bestämmas deras molekylvikt. Vanligtvis för detektion av DNA i gelén som används av specifik färgning( vanligtvis etidiumbromid) och visning av gelén i genomlysning det ultravioletta. Platser av DNA-lokalisering har en röd färg. Emellertid endonukleaser en person i bearbetningen av flera DNA-restriktions bildas så många fragment av olika längder att de misslyckas med att separeras genom elektrofores, är det inte möjligt att visuellt identifiera de individuella DNA-fragmenten att elektrofore-gram( producerad enhetlig färgning över hela längden av gelén).Därför används en hybridiseringsmetod med märkta DNA-prober för att identifiera de önskade DNA-fragmenten i en sådan gel.
Alla segment av enkelsträngat DNA eller RNA kan binda( hybridisera) med dess komplementära kedja, med guanin är alltid förknippad med cytosin, adenin med tymin. Detta är bildandet av en dubbelsträngad molekyl. Om en enkelsträngad kopia av den klonade genen är märkt med en radioaktiv märkning, kommer en sond att erhållas. Sonden kan hitta ett komplementärt segment av DNA, vilket sedan lätt identifieras genom radioautografi. Den radioaktiva proben tillsätts till de läkemedels sträcks kromosomer gör det möjligt att lokalisera genen till en speciell kromosom med en DNA-prob kan identifiera vissa partier i en Southern blöt. Hybridisering sker om testdelen av DNA innehåller en normal gen. I det fall där det finns en onormal sekvens av nukleotider, dvs de motsvarande kromosom strukturer innehåller en mutant gen, hybridisering inte kommer att inträffa, vilket gör det möjligt att bestämma lokalisering av den onormala genen.
För att erhålla DNA-prober används genkloning-metoden. Kärnan i förfarandet består i att det DNA-fragment som motsvarar varje gen eller region av genen insatt i klonings partikel, vanligtvis en bakteriell plasmid( cirkulärt extrakromosomalt DNA närvarande i bakterieceller och som bär resistensgener mot antibiotika), och sedan bakteriernaha en plasmid med en inbyggd human
-gen, multiplicera. Tack vare syntesprocesserna i plasmiden är det möjligt att erhålla miljarder kopior av den mänskliga genen eller dess plats.
Ytterligare kopior av DNA märkt med en radioaktiv märkning eller fluorokrom används som prober för att söka efter komplementära sekvenser bland poolen av DNA-molekyler som studerats.
För närvarande finns det många sorter av metoder som använder DNA-prober för diagnos av genmutationer.