Молекуларне генетичке методе
методе ДНК технологије користе се за одређивање локализације у одређеном хромозом мутантног гена одговорног за порекло одређених облика наследне патологије.Пошто је ген је ДНК сегмент и мутације - оштећења примарне структуре ДНК( мутација се подразумева све промене у ДНК секвенци, независно од њихове локације и утицаја на индивидуалном одрживости) затим истраживања у препарате хромозома метафаза пацијената наследну болест, могуће утврдитилокализација патолошког гена.Методе молекуларне генетике стварају прилике за дијагностиковање болести на нивоу измијењене структуре ДНК, омогућавају откривање локализације насљедних поремећаја.Молекуларне генетичке методе могу открити мутације повезане са заменом чак и једне базе.
Најважнија фаза идентификације гена је његова изолација.ДНК се може изоловати из било које врсте ткива и ћелија које садрже језгре.Кораци ДНК изолације обухватају брзу лизу ћелија центрифугирањем са уклањањем фрагментима ћелијских органела и мембрана, ензимске уништење протеина и њихово екстракцијом из раствора са фенолом и хлороформом, концентрација ДНК преципитацијом у етанолу.
у генетским лабораторијама често ДНК изолована из леукоцита, за које је пацијент узима 5-20 мл венске крви у стерилну епрувету са раствором антикоагуланс( хепарин).Леукоцити се затим раздвајају и обрађују према горе описаним корацима.
Наредна фаза припреме материјала до студија - ДНК "реза" у фрагмената на локацијама са строго специфичну секвенцу основног врши помоћу бактеријских ензима - ендонуклеаза рестрикције( рестрикционим ензимима).Ензими рестрикције препознају специфичне секвенце 4-6, најмање 8-12 нуклеотида у двоструку молекула ДНК и њених раздвојени фрагменте тих секвенци локализују положајима названи рестрикционих места.Број произведено рестрицтион фрагменти ДНК одређен учесталошћу рестрикционих места и фрагмената величине - природе дистрибуције ових локација дуж дужине оригиналне ДНК молекула.Што се често налазе места за ограничавање, краћи су фрагменти ДНК након ограничења.Тренутно је познато више од 500 различитих врста рестрикцијских ензима бактеријског порекла, и сваки од ових ензима препознаје његов специфичан низ нуклеотида.У будућности, места рестрикције могу се користити као генетски маркери за ДНК.Добијени ДНК фрагменти рестрикциони може бити сортирана по дужини електрофорезом у агароза или полиакриламидним геловима, и стога могу се одредити њихову молекуларну тежину.Обично за детекцију ДНК у гелу користи специфичним бојењем( обично етидијум бромид) и прегледате гел пропуштено запали ултраљубичастог.Локације локализације ДНК-а имају црвену боју.Међутим, особа у преради неколико ограничења ДНК ендонуклеаза формирана да толико фрагменте различите дужине да не успевају да буду раздвојени електрофорезе, није могуће визуелно идентификују поједине ДНК фрагмената електрофоре-грам( Продуцед униформна обојеност целом дужином гела).Према томе, метод хибридизације са означеним сондама ДНА се користи за идентификацију жељених фрагмената ДНК у таквом гелу.
Сваки сегмент једноланчани ДНК или РНК може да се веже( хибридизује) са комплементарном ланцем, уз гуанин увек повезан са цитозин, аденин са тимин.Ово је формирање двоструког молекула.Ако је једноручна копија клонираног гена означена радиоактивном ознаком, добива се сонда.Сонда може да пронађе комплементарни сегмент ДНК, који се онда лако идентификује радиоаутографијом.Радиоактивне сонда се додаје хромозома лека растегнут омогућава да локализују ген за одређену хромозом са ДНК сонде може идентифицирати одређене делове у Соутхерн блот.Хибридизација се јавља ако тестни део ДНК садржи нормалан ген.У случају када постоји абнормалан секвенцу нуклеотида, тј одговарајући хромозомске структуре садрже мутант гена, хибридизација неће десити, која омогућава да се утврди локализација абнормалног гена.
Да би се добила ДНА сонда, користи се метод клонирања гена.Суштина методе се састоји у томе ДНК фрагмент одговара сваки ген или регион гена убачено у клонирање честицу, обично бактеријског плазмида( кружну екстрахромозомски ДНК присутна у бактеријским ћелијама и ношење гене резистенције на антибиотике), а затим бактеријуимају плазмид са уграђеним људским
ген, множи се.Због процеса синтезе у плазмиду, могуће је добити милијарде копија људског гена или његовог места.
Даље копије ДНА означене радиоактивном етикетом или флуорохромима користе се као сонде за претраживање комплементарних секвенци међу базом испитаних молекула ДНК.
Тренутно постоји много варијанти метода које користе ДНК сонде за дијагнозу генских мутација.