Molekularne genetske metode
metode tehnologije DNA se uporabljajo za določanje lokalizacije v posameznem kromosomu mutant gena, odgovornega za nastanek nekaterih oblik dednih bolezni. Ker je gen je segment DNA in genske mutacije - poškodba primarne strukture DNA( mutacija se razumejo vse spremembe v sekvenci DNA, ne glede na lokacijo in vpliva na posameznem preživetja), nato merilno preparati kromosomov metafaza bolnikov dedna bolezen, mogoče ugotovitilokalizacija patološkega gena. Metode molekularne genetike ustvariti možnost diagnosticiranja bolezni pri spremenjeni strukturi DNA, ki omogočajo, da se ugotovi lokalizacijo podedovanih motenj. Molekularne genetske metode lahko razkrijejo mutacije, povezane z zamenjavo celo ene baze.
Najpomembnejša stopnja identifikacije genov je njena izolacija. DNK se lahko izolira iz vseh vrst tkiv in celic, ki vsebujejo jedra. Koraki izolacije DNA vključujejo hitro lizo celic s centrifugiranjem z odstranitvijo fragmenti celičnih organel in membran, encimsko uničevanja proteinov in njihovo ekstrakcijo iz raztopine s fenolom in kloroformom, koncentracije DNA z obarjanjem v etanolu.
v genetskih laboratorijih pogosto DNA, izolirano iz levkocitov, pri katerih se upošteva bolnik 5-20 ml vensko kri v sterilno epruveto z raztopino antikoagulanta( heparin).Ljukocite nato ločimo in obdelamo v skladu z zgoraj opisanimi koraki.
naslednji fazi priprave materiala za študije - DNA "cut" v fragmentov na mestih z ozko specifično osnovnega zaporedja izvedemo s pomočjo bakterijskih encimov - restrikcijskimi endonukleazami( restrikcijskih encimov).Restrikcijskimi encimi spoznajo specifične sekvence 4-6, vsaj 8-12 nukleotidov v molekuli dvoverižno DNA in njeni ločeni v fragmentih od teh sekvenc lokalizirajo območij imenovanih restrikcijskih mest.Število proizvaja restrikcijski fragmenti DNA določi frekvenco pojavljanja restrikcijska mesta in fragmenti velikosti - naravo porazdelitve teh mestih vzdolž dolžine prvotne molekule DNA.Čim bolj se nahajajo mesta za omejitve, krajša je DNK fragment po omejitvi. Trenutno obstaja več kot 500 različnih vrst restrikcijskih encimov bakterijskega izvora, in vsaka od teh encima prepozna svojo specifično zaporedje nukleotidov. V prihodnosti se lahko omejitvena mesta uporabijo kot genetski markerji za DNA.Dobljene restrikcijski fragmenti DNA lahko razporejene po dolžini z elektroforezo v agaroznem ali poliakrilamidnem gelu, s čimer se lahko določi njihovo molekulsko maso. Običajno za odkrivanje DNA iz gela s posebnim obarvanjem znamke( običajno etidijev bromid), in si gel v prepuščeni svetlobi na ultravijolično. Lokacije lokalizacije DNA imajo rdečo barvo. Vendar pa oseba pri predelavi več omejitev DNA endonukleazami oblikovana tako veliko fragmente različnih dolžin, da ne morejo biti ločeni s pomočjo elektroforeze, ni mogoče vizualno identifikacijo posameznih fragmentov DNA na elektrofore-gram( pridobljen enotno obarvanje vsej dolžini gela).Zato, da se opredeli ustrezne fragmentov DNA v gelu z uporabo hibridizacijo z označenimi sondami DNK.
Vsak segment enotnega DNA ali RNA sposobna, da se veže( križali) z njeno komplementarno verigo, pri čemer je gvanin vedno povezana s citozin, adenin s timinom. To je tvorba dvojno verižne molekule.Če enoverižna kopija kloniranega gena za označevanje radioaktivno oznako, sondo. Sonda sposobna pridobiti dopolnilno segment DNA, ki ga nato zlahka identificirati z avtoradiografijo. Radioaktivni Sonda se doda kromosomih drog raztegne omogoča lokalizacijo gena na določen kromosom z DNA sondo lahko prepoznajo določene dele v Southern blot. Hibridizacija se pojavi, če testni del DNA vsebuje normalen gen. V primeru, kjer je nenormalni zaporedje nukleotidov, to ustrezne strukture kromosomov vsebuje mutiran gen, hibridizacija ne bo prihajalo, ki omogoča določiti lokalizacije nenormalno gena.
Za pridobitev DNA sond se uporablja metoda kloniranja genov. Bistvo metode je sestavljen s tem, da fragment DNA, ki ustreza kateremkoli gena ali regijo gena, vstavljenega v kloniranja delec, običajno bakterijskem plazmidu( krožnega ekstrakromosomski Trenutno DNA v bakterijskih celicah in prenašanje genov odpornosti na antibiotike), in nato bakterijeki ima plazmid z vgrajenim človeškim
gen, pomnožite. Zahvaljujoč sinteznim procesom v plazmidu je mogoče dobiti milijarde kopij človeškega gena ali mesta.
Nadaljnje kopije DNA, označene z radioaktivnimi nalepkami ali fluorokromi, se uporabljajo kot sonde za iskanje komplementarnih zaporedij med skupino preučenih molekul DNA.
Trenutno obstaja veliko različnih metod, ki uporabljajo DNA sonde za diagnozo genskih mutacij.