Molekylære genetiske metoder

DNA teknologi metoder blir brukt for å bestemme lokaliseringen i et spesielt kromosom av mutantgenet som er ansvarlig for opprinnelsen av visse former av arvelige sykdommer. Siden gen er en DNA-segment og genmutasjon - skade på den primære strukturen til DNA( en mutasjon er forstått av alle endringer i DNA-sekvensen, uavhengig av deres plassering og innflytelsen på de enkelte levedyktighet) deretter sonderings preparater av metafase pasient kromosomer arvelig sykdom, mulig å etablerelokalisering av patologisk gen. Fremgangsmåter for molekylær genetikk for å skape muligheten for diagnostisering av sykdommer hos en endret DNA-struktur, de tillater å fastslå lokaliseringen av arvelige sykdommer. Molekylære genetiske metoder kan avsløre mutasjoner assosiert med erstatning av enda en enkelt base.

Det viktigste stadiet for genidentifikasjon er dets isolasjon. DNA kan isoleres fra hvilken som helst type vev og celleholdige kjerner. Trinnene med ekstraksjon av DNA inkludere hurtig lysering av cellene ved sentrifugering med fjerning av fragmenter av celleorganeller og membraner, enzymatisk destruksjon av proteinene og deres ekstraksjon fra oppløsningen med fenol og kloroform, DNA-konsentrasjon ved utfelling i etanol.

i genetiske laboratorier ofte DNA isolert fra leukocytter, for hvilken pasienten tas 5-20 ml veneblod i et sterilt rør med en oppløsning av en antikoagulant( heparin).Leukocytter separeres deretter og behandles i henhold til trinnene som er skissert ovenfor.

neste trinn i fremstillingen av materialet til studiet - DNA "kutt" i fragmenter på steder med strengt spesifikke basesekvens gjennomføres ved hjelp av bakterielle enzymer - restriksjonsendonukleaser( restriksjonsenzymene).Restriksjonsenzymer gjenkjenne spesifikke sekvenser på 4-6, minst 8-12 nukleotider til dobbelt-trådet DNA-molekyl og dets separeres i fragmenter av disse sekvenser lokalisere områdene kalt restriksjonsseter. Tall produserte restriksjonsfragmenter av DNA bestemmes av frekvensen av forekomsten av restriksjonsseter og fragmenter av størrelse - naturen av fordelingen av disse steder langs lengden av den opprinnelige DNA-molekylet. Jo oftere restriksjonene er plassert, jo kortere DNA-fragmentene etter restriksjon. For tiden er det mer enn 500 forskjellige typer av restriksjonsenzymer av bakteriell opprinnelse, og hver av disse enzym gjenkjenner dens spesifikke sekvens av nukleotider. I fremtiden kan restriksjonsseter brukes som genetiske markører for DNA.De resulterende DNA-restriksjonsfragmenter som kan sorteres etter lengden ved elektroforese i agarose eller polyakrylamidgeler, og således kan bestemmes deres molekylvekt. Vanligvis for påvisning av DNA i gelen som brukes av spesifikk farging( vanligvis etidiumbromid) og visning av gelen i transmitterte lyset det ultrafiolette. Steder av DNA lokalisering har en rød farge. Imidlertid endonukleaser en person i behandlingen av flere DNA-restriksjons dannes så mange fragmenter av forskjellige lengder at de ikke klarer å bli separert ved elektroforese, er det ikke mulig å visuelt identifisere de individuelle DNA-fragmenter til elektrofore-gram( produsert ensartet farging gjennom hele lengden av gelen).Derfor brukes en hybridiseringsmetode med merkede DNA-prober for å identifisere de ønskede DNA-fragmenter i en slik gel.

Enhver segment av enkelt-trådet DNA eller RNA er i stand til å binde( hybridisere) med sin komplementære kjede, med guanin er alltid forbundet med cytosin, adenin med tymin. Dette er dannelsen av et dobbeltstrenget molekyl. Dersom en enkeltkjedet kopi av et klonet gen for å merke en radioaktiv markør, en sonde. Sonden er i stand til å finne et komplementært segment av DNA, som så lett blir identifisert ved radioautografi. Den radioaktive probe ble tilsatt til stoffet strekkes kromosomene gjør det mulig å lokalisere genet til en bestemt kromosom med en DNA-probe kan identifisere visse deler i en Southern blot. Hybridisering oppstår hvis testdelen av DNA inneholder et normalt gen. I det tilfellet hvor det er en unormal sekvens av nukleotider, dvs. de tilsvarende kromosom strukturene inneholder en mutantgenet, hybridisering vil ikke forekomme, noe som gjør det mulig å bestemme lokaliseringen av den unormale genet.

For å oppnå DNA-prober, anvendes genkloning-metoden. Det vesentlige ved fremgangsmåten består i at DNA-fragmentet som svarer til hvilket som helst gen eller region som er ført inn i klonings partikkel, vanligvis et bakterielt plasmid-gen( sirkulært ekstrakromosomalt DNA tilstede i bakterieceller, og som bærer resistensgener for antibiotika), og deretter bakterierå ha et plasmid med et innebygd menneske

-genet, multipliserer. Takket være synteseprosessene i plasmidet, er det mulig å skaffe milliarder eksemplarer av det menneskelige genet eller dets nettsted.

Ytterligere kopier av DNA merket med en radioaktiv etikett eller fluorokrom brukes som prober for å søke etter komplementære sekvenser blant undersøkelsen av DNA-molekyler som er studert.

For tiden er det mange varianter av metoder som bruker DNA-prober til diagnose av genmutasjoner.