Molekuliniai genetiniai metodai
DNR technologija metodai yra naudojami nustatyti lokalizavimui tam tikroje chromosomos mutantinio geno, atsakingo už tam tikrų formų paveldimos ligos kilmės. Nuo genas yra DNR segmentas, ir genų mutacijos - žala pirminės struktūros DNR( mutacija yra suprantama visų DNR sekoje, nepriklausomai nuo jų buvimo vietos ir įtaka individualios gyvybingumo), tada zondavimo preparatai metafazės pacientų chromosomų paveldima liga, galima nustatytipatologinio geno lokalizacija. Metodai molekulinės genetikos sukurti ligų diagnozavimo metodą ne pakitusios DNR struktūrą galimybę, jie leidžia nustatyti, paveldėtos sutrikimų lokalizacijos. Molekuliniai genetiniai metodai gali aptikti mutacijų, susijusių su pakeitimo net vieno pagrindo.
svarbiausias žingsnis identifikuoti geną - jos izoliuojamos. DNR gali būti izoliuota nuo bet kokio tipo audinio ir ląstelių, turinčių branduolių.Šis DNR izoliacijos žingsniai yra greitai lizę ląstelių centrifuguojant su pašalinus fragmentų korinio organoidus ir membranų, fermentinio naikinimo baltymų ir jų ekstrahuojant iš tirpalo su fenolio ir chloroformo, DNR koncentraciją, nusodinant etanoliu.
genetinių laboratorijos dažnai DNR izoliuotas nuo leukocitų, dėl kurių pacientas yra atsižvelgiama 5-20 ml veninio kraujo sterilų mėgintuvėlį su antikoaguliantą( heparino) tirpalo. Tada atskirtų leukocitai ir jų apdorojimas yra atliekamas aukščiau išdėstytus etapus.
Kitas etapas paruošimo medžiagos nuo tyrimų - DNR "supjaustyti" į fragmentus vietose su griežtai konkretaus bazių seką, yra atliekami naudojant bakterijų fermentų - restrikcijos endonukleazių restrikcijos fermentais() .Restrikcijos fermentais pripažinti specifinės sekos, 4-6, ne mažiau kaip 8-12 nukleotidų į dvigrandę DNR molekulės ir jos atskirtų į fragmentus šių sekų lokalizuoti vietų, vadinamų restrikcijos vietos. Numeris gaminamas restrikcijos fragmentai DNR nustatomas pagal atsiradimo restrikcijos vietomis ir fragmentų dydžio dažnio - į šių vietų palei pradinio DNR molekulės ilgio pasiskirstymas pobūdžio. Tuo daugiau restrikcijos vietos, yra, trumpesni DNR fragmentai po virškinimą.Šiuo metu yra daugiau nei 500 skirtingų tipų restrikcijos fermentų bakterinės kilmės, ir kiekvienos iš šių fermento pripažįsta savo konkrečią seką nukleotidų.Vėliau restrikcijos vietos, gali būti naudojamas kaip genetinių markerių DNR.Gaunamos DNR restrikcijos fragmentai gali būti rūšiuojami pagal ilgį elektroforezės agarozės arba poliakrilamido gelyje, ir tokiu būdu gali būti nustatomas jų molekulinę masę.Paprastai DNR aptikimo gelio naudojamo konkretaus dažymo( paprastai etidžio bromido) ir peržiūrėti gelio perduodami lengvojo ultravioletinių.DNR lokalizacijos vietos yra raudonos spalvos. Tačiau, atsižvelgiant į keliose restrikcijos apdorojimo metu endonukleazės suformuota tiek daug fragmentai skirtingų ilgių, kad jie nesugeba būti atskirti elektroforezės, tai nėra įmanoma vizualiai identifikuoti atskirus DNR fragmentus elektrofore-gramui( pagamintą vienodą spalvą visoje gelio ilgio).Todėl, būtų galima nustatyti atitinkamus DNR fragmentai gelyje, naudojant hibridizacija su pažymėtų DNR zondais.
Bet koks viengrandinės DNR segmentas arba RNR geba surišti( hibridizuotis) su savo papildomą grandinės, su guanino yra visada susijęs su citozino, adenino su timino. Tai dvigubos molekulės susidarymas. Jeigu viengrandininė kopija klonuoto geno pažymėti radioaktyviųjų etiketę, zondą.Zondas gali gauti papildomą DNR segmentą, kuris po to lengvai atpažįstamas autoradiografiją.Radioaktyviosios zondas yra įtraukta į narkotikų ištemptas chromosomų leidžia lokalizuoti geną į tam tikrą chromosomos su DNR zondo galima nustatyti tam tikrų Padalintų į porcijas Southern blot. Hibridizacija atsiranda, jei DNR tyrimo dalis turi įprastą geną.Tuo atveju, kai yra nenormalus seka nukleotidų, t.y., atitinkantys chromosomų struktūros jose mutantas geną, hibridizacija nebus, kuri leidžia nustatyti lokalizacijos anomaliąją geno.
Dėl DNR zondais, naudojant genų klonavimo metodą.Metodo esmė yra tai, kad DNR fragmentas, atitinkantis bet geno ar regiono, genas įterpiamas į klonavimo daleles, paprastai bakterijų plazmidės( apskrito ekstrachromosominių DNR esančių bakterijų ląstelių ir vykdymo genus atsparius antibiotikams), o po to bakterijasturinti plazmidę su įmontuotu žmogaus
genas daugintis. Dėl plazmidžių sintezės procesų galima gauti milijardus žmogaus geno kopijų arba jo vietos.
Papildomos DNR, pažymėtos radioaktyvia etikete arba fluorochromais, kopijos yra naudojamos kaip zondai, siekiant ieškoti papildomų sekų tarp tirtų DNR molekulių rinkinio.
Šiuo metu yra daug įvairių metodų, naudojančių DNR zondus genų mutacijų diagnozei.