Metode genetik molekuler
digunakan untuk menentukan lokalisasi pada kromosom tertentu dari gen mutan yang bertanggung jawab atas asal-usul patologi turun-temurun tertentu. Karena gen adalah wilayah DNA, dan mutasi gen adalah kerusakan pada struktur utama DNA( oleh mutasi, itu berarti semua perubahan dalam urutan DNA, terlepas dari lokalisasi dan pengaruhnya terhadap kelangsungan hidup individu), kemudian, dengan memeriksa kromosom metafase pasien dengan penyakit turun-temurun,lokalisasi gen patologis. Metode genetika molekuler menciptakan peluang untuk mendiagnosis penyakit pada tingkat struktur DNA yang berubah, mereka memungkinkan untuk mengetahui lokalisasi gangguan keturunan. Metode genetik molekuler dapat mengungkapkan mutasi yang terkait dengan penggantian bahkan basis tunggal.
Tahap identifikasi gen yang paling penting adalah isolasinya. DNA dapat diisolasi dari semua jenis jaringan dan sel yang mengandung nukleus. Tahapan isolasi DNA meliputi: lisis sel yang cepat, penghilangan organel sel dan membran dengan sentrifugasi, degradasi enzimatik protein dan ekstraksi dari larutan dengan fenol dan kloroform, dan konsentrasi molekul DNA dengan presipitasi dalam etanol.
Di laboratorium genetik, DNA paling sering diisolasi dari leukosit darah, dimana pasien memerlukan 5-20 ml darah vena dalam tabung steril dengan larutan antikoagulan( heparin).Leukosit kemudian dipisahkan dan diproses sesuai dengan langkah-langkah yang diuraikan di atas.
Langkah selanjutnya dalam mempersiapkan bahan untuk penelitian ini adalah "memotong" DNA menjadi fragmen di daerah dengan urutan dasar yang sangat spesifik, yang dilakukan dengan bantuan enzim bakteri - restriksi endonuklease( enzim restriksi).Pembatasan mengenali urutan spesifik 4-6, kurang sering 8-12 nukleotida dalam molekul DNA beruntai ganda dan membaginya menjadi fragmen di lokasi pelokalan sekuens ini, yang disebut situs restriksi. Jumlah fragmen DNA pembatasan yang diproduksi ditentukan oleh frekuensi lokasi restriksi, dan ukuran fragmen ditentukan oleh distribusi situs-situs ini sepanjang panjang molekul DNA asli. Semakin sering lokasi restriksi berada, semakin pendek fragmen DNA setelah restriksi. Saat ini, lebih dari 500 jenis enzim restriksi asal bakteri diketahui, dan masing-masing enzim ini mengenali urutan nukleotida spesifiknya. Ke depan, situs restriksi bisa dijadikan penanda genetik untuk DNA.Fragmen DNA yang terbentuk sebagai hasil pembatasan dapat dipesan sepanjang panjang dengan elektroforesis dalam gel agarosa atau poliakrilamida, dan dengan demikian berat molekulnya dapat ditentukan. Biasanya, pewarnaan spesifik( lebih sering etidium bromida) digunakan untuk mendeteksi DNA dalam gel dan gel dilihat dalam cahaya yang ditransmisikan dari daerah ultraviolet spektrum. Lokasi lokalisasi DNA memiliki warna merah. Namun, pada manusia, saat memproses DNA dengan beberapa enzim restriksi, begitu banyak fragmen dengan panjang yang berbeda terbentuk sehingga tidak dapat dipisahkan oleh elektroforesis, yaitu tidak mungkin untuk secara visual mengidentifikasi fragmen DNA individual pada gram elektroforesis( dapatkan warna genap sepanjang panjang gel).Oleh karena itu, metode hibridisasi dengan probe DNA berlabel digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang diinginkan dalam gel tersebut.
Setiap segmen DNA atau RNA beruntai tunggal dapat mengikat( hibridisasi) ke rantai pelengkapnya, dan guanin selalu dikaitkan dengan sitosin, adenin dengan timin. Ini adalah pembentukan molekul beruntai ganda. Jika satu salinan gen kloning beruntai label dengan label radioaktif, sebuah probe akan diperoleh. Probe ini mampu menemukan segmen pelengkap DNA, yang kemudian mudah diidentifikasi dengan radioografi. Sebuah probe radioaktif yang ditambahkan ke obat kromosom yang diregangkan memungkinkan gen tersebut dilokalisasi pada kromosom tertentu: sampel DNA tertentu dapat diidentifikasi dengan probe DNA di Southern blotting. Hibridisasi terjadi jika bagian uji DNA mengandung gen normal. Dalam kasus di mana urutan nukleotida abnormal hadir, yaitu, struktur kromosom yang sesuai mengandung gen mutan, hibridisasi tidak akan terjadi, yang memungkinkan untuk menentukan lokalisasi gen patologis.
Untuk mendapatkan probe DNA, metode kloning gen digunakan. Inti dari metode ini adalah bahwa fragmen DNA yang sesuai dengan gen atau situs gen dimasukkan ke dalam partikel kloning, biasanya plasmid bakteri( DNA ekstrapromosomular annular yang ada di sel bakteri dan membawa gen resistensi antibiotik), dan kemudian bakteri,memiliki plasmid dengan built-in manusia
Gen, kalikan. Berkat proses sintesis di plasmid, adalah mungkin untuk mendapatkan milyaran salinan gen manusia atau situsnya.
Salinan DNA lebih lanjut yang dilabeli dengan label radioaktif atau fluorochrom digunakan sebagai probe untuk mencari urutan pelengkap di antara kumpulan molekul DNA yang dipelajari.
Saat ini, ada banyak jenis metode yang menggunakan probe DNA untuk diagnosis mutasi gen.