Méthodes génétiques moléculaires
méthodes de technologie de l'ADN sont utilisés pour déterminer la localisation dans un chromosome particulier d'un gène mutant responsable de l'origine de certaines formes de pathologie héréditaire.Étant donné que le gène est un segment d'ADN et la mutation du gène - des dommages à la structure primaire de l'ADN( une mutation est compris par tous les changements dans la séquence d'ADN, indépendamment de leur emplacement et de l'influence sur la viabilité individuelle) puis palpage préparations de chromosomes des patients en métaphase maladie héréditaire, possible d'établirlocalisation du gène pathologique. Les méthodes de génétique moléculaire permettent de diagnostiquer des maladies au niveau de la structure altérée de l'ADN, elles permettent de découvrir la localisation des troubles héréditaires. Les méthodes génétiques moléculaires peuvent révéler des mutations associées au remplacement d'une seule base.
L'étape la plus importante de l'identification des gènes est son isolement. L'ADN peut être isolé de n'importe quel type de tissu et de noyaux contenant des cellules. Les étapes d'isolement de l'ADN comprennent la lyse rapide des cellules par centrifugation à l'élimination de fragments de membranes cellulaires et des organites, la destruction enzymatique des protéines et leur extraction de la solution avec du phénol et du chloroforme, la concentration d'ADN par précipitation dans de l'éthanol.
dans les laboratoires génétiques souvent ADN isolé à partir de leucocytes, pour lequel le patient est prélevé du sang veineux 20.5 ml dans un tube stérile avec une solution d'un anticoagulant( héparine).Les leucocytes sont ensuite séparés et traités selon les étapes décrites ci-dessus.
prochaine étape de préparation du matériau à l'étude - DNA « cut » en fragments sur des sites avec la séquence de bases strictement spécifique est effectuée au moyen d'enzymes bactériennes - endonucléases de restriction( enzymes de restriction).Les enzymes de restriction reconnaissent des séquences spécifiques de 4-6, au moins 8-12 nucleotides dans la molécule d'ADN double brin et ses séparés en fragments de ces séquences des sites localiser appelés sites de restriction. Numéro produit des fragments de restriction d'ADN déterminée par la fréquence d'apparition de sites de restriction et les fragments de taille - la nature de la distribution de ces sites le long de la longueur de la molécule d'ADN d'origine. Plus les sites de restriction sont souvent localisés, plus les fragments d'ADN sont courts après restriction. Actuellement, plus de 500 types différents d'enzymes de restriction d'origine bactérienne sont connus et chacune de ces enzymes reconnaît sa séquence spécifique de nucléotides.À l'avenir, les sites de restriction peuvent être utilisés comme marqueurs génétiques de l'ADN.Les fragments d'ADN formés à la suite d'une restriction peuvent être ordonnés sur toute la longueur par électrophorèse dans un gel d'agarose ou de polyacrylamide, et ainsi leur poids moléculaire peut être déterminé.Habituellement, pour la détection de l'ADN dans le gel utilisé par la coloration spécifique( généralement de bromure d'éthidium) et la visualisation du gel dans la transmission de la lumière ultraviolette. Les localisations de la localisation de l'ADN ont une couleur rouge. Cependant, une personne dans le traitement de plusieurs restriction d'ADN endonucléases formé autant de fragments de longueurs différentes qu'ils ne parviennent pas à être séparés par électrophorèse, il est possible d'identifier visuellement les fragments d'ADN individuels à elektrofore-gramme( produit une coloration uniforme sur toute la longueur du gel).Par conséquent, une méthode d'hybridation avec des sondes d'ADN marquées est utilisée pour identifier les fragments d'ADN désirés dans un tel gel.
Tout segment d'ADN simple brin ou de l'ARN est capable de se lier( hybrider) avec sa chaîne complémentaire, avec la guanine est toujours associée à la cytosine, l'adénine avec thymine. C'est la formation d'une molécule double brin. Si une copie monocaténaire du gène cloné est marquée avec un marqueur radioactif, une sonde sera obtenue. La sonde est capable de trouver un segment complémentaire d'ADN, qui est ensuite facilement identifié par radioautographie. La sonde radioactive est ajoutée aux chromosomes étiré de médicaments permet de localiser le gène à un chromosome particulier avec une sonde d'ADN peut identifier certaines portions dans un transfert de Southern. L'hybridation se produit si la partie test de l'ADN contient un gène normal. Dans le cas où il y a une séquence anormale de nucleotides, à savoir des structures chromosomiques correspondants contiennent un gène mutant, l'hybridation ne se produira pas, ce qui permet de déterminer la localisation du gène anormal.
Pour obtenir des sondes d'ADN, la méthode de clonage de gène est utilisée. L'essence du procédé consiste en ce que le fragment d'ADN correspondant à un gène ou d'une région du gène inséré dans la particule de clonage, habituellement un plasmide bactérien( présent ADN extrachromosomique circulaire dans des cellules bactériennes et portant des gènes de résistance aux antibiotiques), et ensuite les bactériesayant un plasmide avec un
humain intégréGène, multiplier. Grâce aux processus de synthèse dans le plasmide, il est possible d'obtenir des milliards de copies du gène humain ou de son site.
D'autres copies d'ADN marqué avec un marqueur radioactif ou des fluorochromes sont utilisées comme sondes pour rechercher des séquences complémentaires parmi le pool de molécules d'ADN étudiées.
Actuellement, il existe de nombreuses variétés de méthodes utilisant des sondes ADN pour le diagnostic des mutations génétiques.