Molekylære genetiske metoder

DNA teknologi metoder anvendes til bestemmelse af lokalisering i et bestemt kromosom af mutantgenet ansvarlig for oprindelsen af ​​visse former for arvelige sygdomme. Da genet er et DNA-segment og genmutation - skader på den primære struktur af DNA( en mutation forstås af alle ændringer i DNA-sekvensen, uanset deres placering og indflydelsen på den enkelte levedygtighed) derefter probning præparater af metafase patient kromosomer nedarvet sygdom, muligt at etablerelokalisering af patologisk gen. Fremgangsmåder inden for molekylær genetik at skabe mulighed for diagnosticering af sygdomme på en ændret DNA-struktur, de tillader at fastslå lokaliseringen af ​​arvelige sygdomme. Molekylære genetiske metoder kan afsløre mutationer forbundet med udskiftning af endog en enkelt base.

Det vigtigste trin i genidentifikation er dets isolering. DNA kan isoleres fra enhver type væv og celleholdige kerner. Trinene DNA-isolering omfatter hurtig lyse af cellerne ved centrifugering med fjernelse af fragmenter af cellulære organeller og membraner, enzymatisk nedbrydning af proteiner og deres udvinding fra opløsningen med phenol og chloroform, DNA-koncentration ved udfældning i ethanol.

i genetiske laboratorier ofte DNA isoleret fra leukocytter, som patienten er truffet 5-20 ml veneblod i et sterilt rør med en opløsning af en antikoagulant( heparin).Leukocytter separeres derefter og behandles i overensstemmelse med trinene beskrevet ovenfor.

næste fase i forberedelsen af ​​materialet til undersøgelsen - DNA "cut" i fragmenter på steder med strengt specifik basesekvens udføres ved hjælp af bakterielle enzymer - restriktionsendonucleaser( restriktionsenzymer).Restriktionsenzymer genkender specifikke sekvenser af 4-6, mindst 8-12 nukleotider i dobbeltstrenget DNA-molekyle og dets adskilt i fragmenter af disse sekvenser lokalisere områder kaldet restriktionssteder. Antal producerede restriktionsfragmenter af DNA bestemt ved hyppigheden af ​​forekomsten af ​​restriktionssteder og fragmenter af størrelse - arten af ​​fordelingen af ​​disse steder langs længden af ​​den oprindelige DNA-molekyle. Jo oftere restriktionsstederne er placeret, jo kortere DNA-fragmenterne efter restriktion. I øjeblikket er der mere end 500 forskellige typer af restriktionsenzymer af bakteriel oprindelse, og hver af disse enzym genkender dens specifikke sekvens af nukleotider. I fremtiden kan restriktionssteder anvendes som genetiske markører for DNA.De resulterende DNA restriktionsfragmenter kan sorteres efter længde ved elektroforese i agarose eller polyacrylamidgeler, og således kan bestemmes deres molekylvægt. Sædvanligvis til påvisning af DNA i gelen anvendes af specifik farvning( sædvanligvis ethidiumbromid) og visning af gelen i transmitteret lys ultraviolet. Steder af DNA lokalisering har en rød farve. Imidlertid Endonukleaser en person i behandlingen af ​​flere DNA-restriktion dannet så mange fragmenter af forskellige længder, at de undlader at adskilles ved elektroforese, er det ikke muligt visuelt at identificere de enkelte DNA-fragmenter til elektrofore-gram( produceret ensartet farvning gennem hele længden af ​​gelen).Derfor anvendes en hybridiseringsmetode med mærkede DNA-prober til identifikation af de ønskede DNA-fragmenter i en sådan gel.

Enhver segment af enkeltstrenget DNA eller RNA kan binde( hybridisere) med dets komplementære kæde, med guanin er altid forbundet med cytosin, adenin med thymin. Dette er dannelsen af ​​et dobbeltstrenget molekyle. Hvis en enkeltstrenget kopi af et klonet gen til at tagge et radioaktivt mærke, en probe. Sonden kan finde et komplementært segment af DNA, som så let kan identificeres ved radioautografi. Den radioaktive probe tilsættes til narkotika strakt kromosomer gør det muligt at lokalisere genet til et særligt kromosom med en DNA-probe kan identificere visse dele i et Southern blot. Hybridisering sker, hvis testdelen af ​​DNA'et indeholder et normalt gen. I det tilfælde, hvor der er en unormal sekvens af nukleotider, dvs. de tilsvarende kromosom strukturer indeholder et mutantgen, vil hybridisering ikke forekomme, hvilket gør det muligt at bestemme lokalisering af det unormale gen.

For at opnå DNA-prober anvendes genkloningmetoden. Essensen af ​​fremgangsmåden består i, at DNA-fragmentet svarende til enhver gen eller region af genet indsat i kloning partikel, sædvanligvis et bakterielt plasmid( cirkulært ekstrakromosomalt DNA til stede i bakterieceller og transporterer resistensgener over for antibiotika), og derefter bakterierneat have et plasmid med en indbygget human

gen, formere. På grund af synteseprocesserne i plasmidet er det muligt at opnå milliarder af kopier af det humane gen eller dets sted.

Yderligere kopier af DNA mærket med en radioaktiv mærkning eller fluorochrom anvendes som prober for at søge efter komplementære sekvenser blandt undersøgt pool af DNA-molekyler.

I øjeblikket findes der mange forskellige metoder, der anvender DNA-prober til diagnose af genmutationer.