Molekularne genetske metode
metode DNA tehnologije koriste za određivanje lokalizaciju u određenom kromosomu mutiranog gena odgovornog za podrijetla određenih oblika nasljednih bolesti. Budući da je gen je segment DNK i genske mutacije - štetu na primarne strukture DNA( mutacija je razumjeti sve promjene u DNA sekvence, bez obzira na njihov položaj i utjecaj na pojedinca održivosti), a zatim sondiranje preparati metafaza pacijenata kromosoma nasljedna bolest, moguće utvrditilokalizacija patološkog gena. Metode molekularne genetike stvoriti mogućnost dijagnosticiranju bolesti u promijenjenom strukture DNA, dopuštaju da se utvrdi lokalizacije nasljednih bolesti. Molekularne genetske metode mogu otkriti mutacije povezane s zamjenom čak i jedne baze.
Najvažnija faza identifikacije gena jest njegova izolacija. DNA se može izolirati iz bilo kojeg tipa tkiva i stanica koje sadrže jezgre. Koraci izolacije DNA uključuju brzo lizu stanica centrifugiranjem uz uklanjanje fragmenata staničnih organela i membrane, enzimske uništavanje proteina i njihove ekstrakcije iz otopine sa fenolom i kloroformom, koncentracija DNA taloženjem u etanolu.
u genetskim laboratorijima često DNA izolirana iz leukocita, za koje pacijent uzima 5-20 ml venske krvi u sterilnu epruvetu sa otopinom antikoagulant( heparin).Zatim se leukociti razdvoje i obrade u skladu s gore opisanim koracima.
sljedeći korak za dobivanje materijala za studije - DNK „cut” u fragmenata na mjestima sa strogo određenu baznu sekvence se izvodi pomoću bakterijskim enzimima restrikcije endonukleaze -( restrikcijski enzimi).Restrikcijski enzimi prepoznaju specifične sekvence 4-6, najmanje 8-12 nukleotida u dvostruke uzvojnice DNA molekula i njegove odvojene u fragmentima ovih sekvenci lokalizirati nalazišta restrikcijska mjesta. Broj proizveden restrikcijski fragmenti DNA određena frekvencijom pojave restrikcijskih mjesta i fragmenata veličine - prirodi razdiobe tih mjesta duž duljine izvorne DNA molekule.Što su češće mjesta za restrikcije smještena, kraći fragmenti DNA nakon ograničenja. Trenutno postoji više od 500 različitih vrsta restrikcijskih enzima bakterijskog podrijetla, a svaka od tih enzima prepoznaje svoju specifičnu sekvencu nukleotida. U budućnosti, restrikcijska mjesta mogu se koristiti kao genetički markeri za DNA.Nastali DNA restrikcijski fragmenti mogu biti poredane po dužini elektroforezom na agaroznom gelu ili poliakrilamidnim, a time se može odrediti molekularnu masu. Obično za detekciju DNA u gela koriste posebne bojenjem etidijevim bromidom( obično) i gledanje gel u prenosi svjetlo ultraljubičasti. Lokacije DNA lokalizacije imaju crvenu boju. Međutim, osoba u obradi nekoliko DNA restrikcijskim endonukleazama oblikovan tako mnogo fragmenti različitih duljina da oni ne mogu razdvojiti elektroforeze, nije moguće da se vizualno identificiraju pojedinačne DNA fragmenata na elektrofore-gram( proizvedenog ravnomjernu boju cijelom dužinom u gel).Stoga se koristi hibridizacijska metoda sa obilježenim DNK sondama za identificiranje željenih fragmenata DNA u takvom obliku gela. Svaki segment
jednolančane DNA ili RNA može vezati( hibridiziraju) s komplementarnim lancem, s gvanin uvijek je povezana s citozin, adenin s timina. Ovo je stvaranje dvolančane molekule. Ako je jednolančana kopija kloniranog gena obilježena radioaktivnom oznakom, dobit će se sonda. Sonda je u mogućnosti pronaći komplementarni segment DNA, koji se zatim lako identificira radioautografijom. Sonda je radioaktivni dodaje se lijek rastegnut omogućava kromosoma lokalizirati gena određenog kromosoma s DNA sondom prepoznati određene dijelove u Southern blot. Hibridizacija se javlja ako testni dio DNA sadrži normalan gen. U slučaju kada postoji abnormalno slijed nukleotida, tj odgovarajuće strukture kromosom sadrži mutirani gen, hibridizacija se neće pojaviti, koji omogućuje da se odredi lokalizaciju nenormalnog gena.
Za dobivanje DNK probe koristi se metoda kloniranja gena. Suština metode se sastoji u tome DNA fragment koji odgovara svakom genu ili regiju gena umetnutog u čestice kloniranja, obično bakterijske plazmid( kružni ekstrakromosomski DNA prisutnom u bakterijskim stanicama, a koji nosi gene za rezistenciju na antibiotike), a zatim bakterijes plazmidom s ugrađenim ljudskim
gen, pomnožite. Zahvaljujući postupcima sinteze u plazmidu, moguće je dobiti milijarde kopija ljudskog gena ili njegovog mjesta.
Daljnje kopije DNA obilježene radioaktivnom oznakom ili fluorokromima koriste se kao probe za traženje komplementarnih sekvenci među skupinom istraživanih DNA molekula.
Trenutno postoje mnoge vrste metoda koje koriste DNA probe za dijagnozu mutacija gena.