Molekulargenetische Methoden
DNA-Technologie-Methoden werden verwendet, um die Lokalisierung in einem bestimmten Chromosom eines mutierten Gens zu bestimmen, das für den Ursprung bestimmter Formen der erblichen Pathologie verantwortlich ist. Da das Gen ein DNA-Segment und Genmutation - Schaden an der Primärstruktur von DNA( eine Mutation von allen Änderungen in der DNA-Sequenz verstanden, unabhängig von ihrem Standort und dem Einfluss auf die einzelnen Lebensfähigkeit) dann Sondieren Präparationen von Metaphase Patientenchromosomen Erbkrankheit, möglich festzustellen, Lokalisierung des pathologischen Gens. Methoden der Molekulargenetik eröffnen Möglichkeiten, Krankheiten auf der Ebene der veränderten DNA-Struktur zu diagnostizieren, sie ermöglichen es, die Lokalisation von Erbkrankheiten herauszufinden. Molekulargenetische Methoden können Mutationen aufdecken, die mit dem Ersatz einer einzigen Base zusammenhängen.
Die wichtigste Stufe der Genidentifizierung ist ihre Isolierung. DNA kann aus jeder Art von Gewebe und Zelle, die Kerne enthält, isoliert werden. Die Schritte der DNA-Isolierung umfassen schnelle Lyse der Zellen durch Zentrifugation mit der Entfernung von Fragmenten von Zellorganellen und Membranen, enzymatischer Zerstörung von Proteinen und ihrer Extraktion aus der Lösung mit Phenol und Chloroform, DNA-Konzentration durch Ausfälle in Ethanol.
in Laboratorien häufig genetischen DNA aus Leukozyten isoliert, für das der Patient in 5-20 ml venöses Blut in einem sterilen Röhrchen mit einer Lösung aus einem Antikoagulans( Heparin) aufgenommen wird. Leukozyten werden dann gemäß den oben beschriebenen Schritten getrennt und verarbeitet.
nächste Stufe der Herstellung des Materials zur Studie - Restriktionsendonukleasen( Restriktionsenzym) - DNA „Schnitt“ in Fragmente an Stellen mit streng spezifischer Basensequenz wird durch bakterielle Enzyme durchgeführt. Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzen von 4-6 mindestens 8-12 Nukleotide in doppelsträngige DNA-Molekül und deren getrennt in Fragmente dieser Sequenzen zu lokalisieren Seiten Restriktionsstellen genannt. Die Menge der erzeugten Restriktions-DNA-Fragmente wird durch die Häufigkeit der Restriktionsstellen bestimmt, und die Größe der Fragmente wird durch das Verteilungsmuster dieser Stellen entlang der Länge des ursprünglichen DNA-Moleküls bestimmt. Je öfter die Restriktionsstellen lokalisiert sind, desto kürzer sind die DNA-Fragmente nach der Restriktion. Gegenwärtig sind mehr als 500 verschiedene Arten von Restriktionsenzymen bakteriellen Ursprungs bekannt, und jedes dieser Enzyme erkennt seine spezifische Nukleotidsequenz. Zukünftig können Restriktionsstellen als genetische Marker für DNA verwendet werden. Die durch Restriktion gebildeten DNA-Fragmente können entlang der Länge durch Elektrophorese in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel angeordnet werden, und somit kann ihr Molekulargewicht bestimmt werden. In der Regel für den Nachweis von DNA in dem Gel durch spezifische Färbung verwendet( in der Regel Ethidiumbromid) und Anzeigen des Gels im Durchlicht das ultraviolettes. Orte der DNA-Lokalisierung haben eine rote Farbe. Jedoch Endonukleasen eine Person bei der Verarbeitung von mehreren DNA-Restriktions so viele Fragmente unterschiedlicher Länge ausgebildet ist, dass sie durch Elektrophorese getrennt werden ausfallen, ist es nicht möglich, visuell die einzelne DNA-Fragmente zu identifizieren elektrofore Gramm( hergestellt einheitliche Färbung auf der ganzen Länge des Gels).Daher wird ein Hybridisierungsverfahren mit markierten DNA-Sonden verwendet, um die gewünschten DNA-Fragmente in einem solchen Gel zu identifizieren.
Jedes Segment von einzelsträngiger DNA oder RNA in der Lage ist zu binden( hybridisieren) mit seiner komplementären Kette, mit Guanin immer mit Cytosin, Adenin mit Thymin zugeordnet ist. Dies ist die Bildung eines doppelsträngigen Moleküls. Wenn eine einzelsträngige Kopie des klonierten Gens mit einer radioaktiven Markierung markiert ist, wird eine Sonde erhalten. Die Sonde ist in der Lage, ein komplementäres DNA-Segment zu finden, das dann durch Radioautographie leicht identifiziert werden kann. Die radioaktive Sonde wird hinzugefügt, um die Droge gereckt Chromosomen ermöglicht, das Gen zu einem bestimmten Chromosom mit einer DNA-Sonde lokalisieren kann bestimmte Abschnitte in einem Southern-Blot identifiziert werden. Die Hybridisierung tritt auf, wenn der Testabschnitt der DNA ein normales Gen enthält. In dem Fall, wo eine anormale Sequenz von Nukleotiden ist, das heißt die entsprechenden Chromosoms Strukturen enthalten ein mutiertes Gen, Hybridisierung nicht auftreten wird, die die Lokalisierung des anomalen Gens zu bestimmen erlaubt.
Um DNA-Sonden zu erhalten, wird das Gen-Klonierungsverfahren verwendet. Das Wesen des Verfahrens besteht darin, dass das DNA-Fragment, das das Klonieren Teilchen eingefügt in, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, ein Gen oder eine Region des Gens entspricht( circular extrachromosomale DNA in Bakterienzellen und Gene, die Resistenz gegen die Antibiotika tragen), und dann die Bakterienein Plasmid mit einem eingebauten menschlichen
aufweist-Gen, multiplizieren. Dank der Synthesevorgänge in dem Plasmid ist es möglich, Milliarden von Kopien des menschlichen Gens oder seiner Stelle zu erhalten.
Weitere Kopien von DNA, die mit einer radioaktiven Markierung oder Fluorochromen markiert ist, werden als Sonden verwendet, um nach komplementären Sequenzen innerhalb des Pools von untersuchten DNA-Molekülen zu suchen.
Gegenwärtig gibt es viele verschiedene Methoden, die DNA-Sonden zur Diagnose von Genmutationen verwenden.