Métodos genéticos moleculares
são usados para determinar a localização em um cromossomo particular de um gene mutante responsável pela origem de certas formas de patologia hereditária. Uma vez que o gene é uma região do DNA e a mutação dos genes é o dano à estrutura primária do DNA( por mutação eles significam todas as mudanças na seqüência do DNA, independentemente da sua localização e influência na viabilidade do indivíduo), então, investigando os cromossomos da metafase de um paciente com doença hereditária,localização do gene patológico. Os métodos de genética molecular criam oportunidades para diagnosticar doenças ao nível da estrutura de DNA alterada, permitindo descobrir a localização de distúrbios hereditários. Os métodos genéticos moleculares podem revelar mutações associadas à substituição de uma única base.
O estágio mais importante da identificação de genes é o seu isolamento. O DNA pode ser isolado de qualquer tipo de tecido e núcleos contendo células. As etapas do isolamento do DNA incluem: lise celular rápida, remoção de organelas celulares e membranas por centrifugação, degradação enzimática de proteínas e sua extração da solução com fenol e clorofórmio e concentração de moléculas de DNA por precipitação em etanol.
Em laboratórios genéticos, o DNA é mais frequentemente isolado de leucócitos sanguíneos, para os quais o paciente leva 5-20 ml de sangue venoso em um tubo estéril com uma solução anticoagulante( heparina).Os leucócitos são então separados e processados de acordo com as etapas descritas acima.
O próximo passo na preparação do material para o estudo é "cortar" o DNA em fragmentos em áreas com uma seqüência básica estritamente específica, que é realizada com a ajuda de enzimas bacterianas - endonucleases de restrição( enzimas de restrição).As restrictases reconhecem sequências específicas de 4-6, menos frequentemente 8-12 nucleótidos em uma molécula de DNA de cadeia dupla e dividem-na em fragmentos nos locais de localização dessas sequências, chamados de locais de restrição. O número de fragmentos de DNA de restrição produzidos é determinado pela frequência dos locais de restrição e o tamanho dos fragmentos é determinado pela distribuição destes locais ao longo do comprimento da molécula de DNA original. Quanto mais freqüentemente os locais de restrição estiverem localizados, menor será o fragmento de DNA após a restrição. Atualmente, são conhecidos mais de 500 diferentes tipos de enzimas de restrição de origem bacteriana, e cada uma dessas enzimas reconhece sua seqüência específica de nucleotídeos. No futuro, os sites de restrição podem ser usados como marcadores genéticos para o DNA.Os fragmentos de DNA formados como resultado da restrição podem ser ordenados ao longo do comprimento por eletroforese num gel de agarose ou poliacrilamida e, assim, o seu peso molecular pode ser determinado. Normalmente, uma coloração específica( mais frequentemente brometo de etidio) é usada para detectar DNA no gel e o gel é visto na luz transmitida da região ultravioleta do espectro. Locais de localização de DNA têm uma cor vermelha. No entanto, nos seres humanos, ao processar o DNA com várias enzimas de restrição, são formados tantos fragmentos de diferentes comprimentos que não podem ser separados por eletroforese, isto é, não é possível identificar individualmente fragmentos de DNA individuais na gramagem de eletroforese( obtenha uma cor uniforme em todo o comprimento do gel).Portanto, um método de hibridação com sondas de DNA marcadas é usado para identificar os fragmentos de DNA desejados em um tal gel.
Qualquer segmento de DNA ou RNA de cadeia simples é capaz de se ligar( hibridar) à sua cadeia complementar, e a guanina está sempre associada à citosina, à adenina com timina. Esta é a formação de uma molécula de cadeia dupla. Se uma cópia de cadeia simples do gene clonado é rotulada com um rótulo radioativo, será obtida uma sonda. A sonda é capaz de encontrar um segmento complementar de DNA, que é facilmente identificado pela radioautografia. Uma sonda radioativa adicionada a uma droga de cromossomos esticados permite que o gene seja localizado em um determinado cromossomo: certas amostras de DNA podem ser identificadas com uma sonda de DNA em Southern Blot. A hibridação ocorre se a porção de teste do DNA contém um gene normal. No caso em que uma sequência anormal de nucleótidos está presente, ou seja, as estruturas cromossômicas correspondentes contêm um gene mutante, não ocorrerá hibridação, o que permite determinar a localização do gene patológico.
Para obter sondas de DNA, o método de clonagem de genes é usado. A essência do método é que um fragmento de DNA correspondente a um gene ou a um local de gene é inserido na partícula de clonagem, usualmente um plasmídeo bacteriano( DNA extracromossômico anular presente em células bacterianas e portadores de genes de resistência a antibióticos) e, em seguida, bactérias,tendo um plasmídeo com um
humano incorporadoGene, multiplique. Graças aos processos de síntese no plasmídeo, é possível obter bilhões de cópias do gene humano ou do seu site.
Outras cópias de DNA marcado com um rótulo radioativo ou fluorocromos são usadas como sondas para procurar seqüências complementares entre o conjunto de moléculas de DNA estudadas.
Atualmente, existem muitas variedades de métodos usando sondas de DNA para o diagnóstico de mutações genéticas.