Metode genetice genetice
sunt folosite pentru a determina localizarea într-un anumit cromozom al genei mutante responsabile pentru originea anumitor forme de boli ereditare. Deoarece gena este un segment de ADN și mutația genelor - deteriorarea structurii primare a ADN-ului( o mutație este înțeleasă de către toate modificările în secvența de ADN, indiferent de localizarea lor și influența asupra viabilității individuale), boala apoi sondare preparate de cromozomi pacient metafaza moștenit, este posibil să se stabileascălocalizarea genei patologice. Metodele geneticii moleculare creează oportunități pentru diagnosticarea bolilor la nivelul structurii ADN modificate, permit identificarea localizării tulburărilor ereditare. Metodele genetice genetice pot dezvălui mutații asociate cu înlocuirea chiar a unei singure baze.
Cea mai importantă etapă a identificării genei este izolarea acesteia. ADN-ul poate fi izolat de orice tip de țesut și celule conținând nuclei. Etapele de izolare ADN-ului includ liza rapidă a celulelor prin centrifugare, cu îndepărtarea fragmentelor de organitelor și a membranelor celulare, distrugerea enzimatică a proteinelor și extragerea lor din soluție cu fenol și cloroform, concentrația de ADN prin precipitare în etanol.
in laboratoare genetice adesea ADN izolat din leucocite, pentru care pacientul este luat 5-20 sânge venos ml într-un tub steril cu o soluție de anticoagulant( heparină).Leucocitele sunt apoi separate și procesate în conformitate cu etapele descrise mai sus.
urmatoarea etapa de preparare a materialului pentru studiu - DNA „tăiat“ în fragmente de la site-uri cu secvență de baze strict specifice se realizează cu ajutorul enzimelor bacteriene - endonucleazele de restricție( enzime de restricție).Enzimele de restricție recunosc secvențe specifice de 4-6, cel puțin 8-12 nucleotide în molecula de ADN dublu catenar și separate în fragmente ale acestor secvențe localizeze siturile sale numite situri de restricție. Număr produs fragmente de restricție ale ADN-ului determinate de frecvența apariției de situsuri de restricție și fragmente de dimensiuni - natura distribuției acestor situri pe lungimea moleculei de ADN original. Cu cât sunt localizate mai des locurile de restricție, cu atât fragmentele ADN sunt mai scurte după restricție.În prezent, sunt cunoscute mai mult de 500 de tipuri diferite de enzime de restricție de origine bacteriană și fiecare dintre aceste enzime recunoaște secvența specifică de nucleotide.În viitor, siturile de restricție pot fi utilizate ca markeri genetici pentru ADN.Rezultate Fragmentele de restricție ADN pot fi sortate după lungime prin electroforeză în geluri de agaroză sau de poliacrilamidă, și astfel pot fi determinate greutatea lor moleculară.De obicei, pentru detectarea ADN-ului în gel utilizat prin colorare specifică( bromură de obicei etidiu) și vizualizarea gelului în lumina transmisă ultraviolet. Locațiile localizării ADN-ului au o culoare roșie. Cu toate acestea, o persoană în procesarea mai multor restricție ADN endonucleases format atât de multe fragmente de lungimi diferite, încât să nu fie separate prin electroforeză, nu este posibil să se identifice vizual fragmentele de ADN individuale elektrofore gram( colorație uniformă produsă pe toată lungimea gelului).Prin urmare, o metodă de hibridizare cu sonde de ADN marcate este utilizată pentru a identifica fragmentele ADN dorite într-un astfel de gel.
Orice segment al ADN-ului monocatenar sau ARN-ul este capabil de a lega( hibridiza) cu lanțul său complementar, cu guanina este întotdeauna asociat cu citozina, adenina cu timina. Aceasta este formarea unei molecule dublu-catenare. Dacă o copie mono-catenară a genei clonate este marcată cu o etichetă radioactivă, se va obține o sondă.Sonda este capabilă să găsească un segment complementar de ADN, care este ușor identificat prin radioautografie. Sonda radioactivă este adăugată la droguri intins cromozomi permite sa localizeze gena pentru un anumit cromozom cu o sondă ADN poate identifica anumite porțiuni într-o analiză Southern blot. Hibridizarea apare dacă porțiunea de test a ADN conține o genă normală.În cazul în care există o secvență anormală de nucleotide, adică structurile cromozomiale corespunzătoare conțin o genă mutantă, hibridizare nu va avea loc, ceea ce permite determinarea localizarea genei anormale.
Pentru a obține probele ADN, se folosește metoda de donare a genei. Esența metodei constă în aceea că fragmentul ADN corespunzător oricărei gene sau regiune a genei inserate în particula de clonare, de obicei, o plasmidă bacteriană( circular extracromozomial ADN-ul prezent în celulele bacteriene și care transportă genele de rezistență la antibiotice) și apoi bacteriileavând o plasmidă cu
umană încorporatăGena, se înmulțește. Datorită proceselor de sinteză din plasmidă, este posibil să se obțină miliarde de exemplare ale genei umane sau ale locului său.
Alte copii ale ADN-ului marcat cu o etichetă radioactivă sau fluorochromi sunt folosite ca sonde pentru a căuta secvențe complementare printre grupurile de molecule de ADN studiate.
În prezent există numeroase varietăți de metode care utilizează sonde ADN pentru diagnosticarea mutațiilor genetice.