Molekyyliset geneettiset menetelmät
-DNA-tekniikan menetelmiä käytetään määrittämään lokalisointi tietyssä muuntogeenisen geenin kromosomissa, joka on vastuussa tiettyjen perinnöllisten patologioiden muodoista. Koska geeni on DNA-segmentti, ja geenin mutaatio - vahinkoa ensisijainen DNA: n rakenteen( mutaatio ymmärtävät kaikki muutokset DNA-sekvenssissä, riippumatta niiden sijainnista ja vaikutus yksittäisten elinkelpoisuus) sitten koettimien valmisteet metafaasin potilaan kromosomien perinnöllinen sairaus, voidaan vahvistaapatologisen geenin lokalisointi. Molekyyligenetiikan menetelmät luovat mahdollisuuksia diagnosoida sairauksia muunnetun DNA-rakenteen tasolla, ja ne mahdollistavat perinnöllisten häiriöiden lokalisoitumisen. Molekyyliset geneettiset menetelmät voivat paljastaa mutaatioita, jotka liittyvät jopa yhden emäksen korvaamiseen.
Geenin tunnistamisen tärkein vaihe on sen eristäminen. DNA voidaan eristää mistä tahansa kudoksesta ja solusta sisältävistä ytimistä.Vaiheet DNA: n eristystä varten sisältyvät nopea solujen lyysin sentrifugoimalla poistamalla fragmenttien soluelinten ja kalvot, entsymaattinen tuhoaminen proteiinien ja niiden erottaminen liuoksesta fenolilla ja kloroformilla, DNA-pitoisuus saostamalla etanolissa.
geneettinen laboratorioissa usein eristetty DNA leukosyyteistä, jonka potilas on otettu 5-20 ml laskimoverta steriilissä putkessa liuosta, jossa on antikoagulantin( hepariini).Sitten leukosyytit erotetaan ja käsitellään yllä kuvattujen vaiheiden mukaisesti.
seuraavassa vaiheessa materiaalin valmistusta tutkimuksen - DNA "leikkaa" palasiksi paikoissa, joissa on ainoastaan spesifinen emässekvenssin suoritetaan avulla bakteerien entsyymien - restriktioendonukleaaseilla( restriktioentsyymeillä).Restriktioentsyymit tunnistavat spesifisiä sekvenssejä 4-6, ainakin 8-12 nukleotidia kaksijuosteiseen DNA-molekyyli ja sen erottaa näiden sekvenssien fragmentteja paikallistaa kohdissa, joita kutsutaan restriktiokohtia. Numero valmistettu restriktiofragmentit DNA määritettiin esiintymistiheyden restriktiokohtien ja fragmentit, joiden koko on - luonne jakelu näiden sivustojen pituudella alkuperäisen DNA-molekyylin. Mitä useammin restriktiokohteet sijaitsevat, sitä lyhyempi DNA-fragmentit rajoituksen jälkeen. Tällä hetkellä tunnetaan yli 500 erilaista bakteeriperäistä restriktioentsyymiä ja kukin näistä entsyymeistä tunnistaa sen spesifisen nukleotidisekvenssin. Tulevaisuudessa restriktiokohtia voidaan käyttää geneettisiksi markkereiksi DNA: lle. Saatu DNA restriktiofragmentit voidaan lajitella pituuden mukaan elektroforeesilla agaroosi- tai polyakryyliamidigeeleissä, ja näin voidaan määrittää niiden molekyylipaino. Yleensä DNA: n ilmaisemiseksi geelissä käytetään spesifistä värjäytymistä( yleensä etidiumbromidia) ja katsella geeli lähetetty valo ultravioletti. DNA-lokalisoinnin sijainnit ovat punaisia. Kuitenkin henkilö käsittelyssä useiden DNA-restriktioendonukleaaseilla muodostettu niin monia eri pituisia fragmentteja, että ne eivät voi erottaa elektroforeesilla, se ei ole mahdollista visuaalisesti tunnistaa yksilön DNA-fragmentteja elektrofore gramman( valmistettu yhtenäinen väri koko pituudelta geelin).Siksi käytetään hybridisaatiomenetelmää leimattujen DNA-koettimien kanssa halutun DNA-fragmentin identifioimiseksi tällaisessa geelissä.
tahansa segmentti yksijuosteista DNA: ta tai RNA pystyy sitoutumaan( hybridisoitumaan) ja sen komplementaarinen ketju, jossa on guaniini liittyy aina sytosiinin, adeniinin tymiinin kanssa. Tämä on kaksisäikeisen molekyylin muodostuminen. Jos yksijuosteinen kopio kloonatuista geeneistä on leimattu radioaktiivisella leimalla, saadaan koetin. Koetin kykenee löytämään komplementaarisen DNA-segmentin, joka sitten tunnistetaan helposti radioautografialla. Radioaktiivinen koetin lisätään lääkeaineen venytetty kromosomien mahdollistaa paikallistaa geenin tiettyyn kromosomiin DNA-koetin voidaan tunnistaa tietyt osat on Southern blot. Hybridisaatio tapahtuu, jos DNA: n testiohjelma sisältää normaalin geenin. Tapauksessa, jossa on epänormaalin sekvenssin nukleotidien, eli vastaava kromosomi rakenteet sisältävät mutantti geeni, hybridisaatiota ei tapahdu, jonka avulla voidaan määrittää lokalisoinnin epänormaali geenin.
DNA-koettimien saamiseksi käytetään geenin kloonausmenetelmää.Ydin menetelmä koostuu siitä, että DNA-fragmentti, joka vastaa mihin tahansa geeniin tai geenin alueen insertoidaan kloonausta hiukkanen, yleensä bakteeriplasmidin( pyöreä kromosomin DNA: ta on läsnä bakteerisoluissa ja kuljettaa resistenssigeenit antibiootteja), ja sitten bakteeritjolla on plasmidi sisäänrakennetulla ihmisellä
-geeni, kerrotaan. Plasmidin synteesiprosessien ansiosta on mahdollista saada miljardeja kopioita ihmisen geenistä tai sen alueesta.
Radioaktiivisen etiketin tai fluorokromien kanssa leimattuja DNA: n kopioita käytetään koettimina etsimään komplementaarisia sekvenssejä tutkittujen DNA-molekyylien joukossa.
Tällä hetkellä on olemassa monenlaisia menetelmiä, joissa käytetään DNA-koettimia geenimutaatioiden diagnosointiin.