Molekulaargeneetilised meetodid
DNA tehnoloogia meetodeid kasutatakse konkreetsete päriliku patoloogia vormide päritolu eest vastutava mutantse geeni lokaliseerimise kindlaksmääramiseks. Kuna geen on DNA segment ja geenimutatsiooni - kahjustatud primaarstruktuuris DNA( mutatsioon on mõistetav kõigile muutused DNA järjestus, sõltumata nende asukohast ja mõju üksikute elujõulisus) seejärel sondeerimine preparaadid metafaasi patsiendi kromosoomid pärilik haigus, võimalik tuvastadapatoloogilise geeni lokaliseerimine. Molekulaargeneetika meetodid loovad võimalused haiguste diagnoosimiseks muutunud DNA struktuuri tasandil, võimaldavad nad tuvastada pärilike häirete lokaliseerimist. Molekulaargeneetilised meetodid võivad avaldada mutatsioone, mis on seotud isegi ühe aluse asendamisega.
Geeni identifitseerimise kõige olulisem staadium on selle isolatsioon. DNA võib eraldada mis tahes tüüpi koest ja rakku sisaldavatest tuumikutest. Järgmisi etappe DNA eraldamise sisaldavad kiiret rakkude lüüsi tsentrifuugimise eemaldamisega fragmendid rakulise organellid ja membraane, ensümaatiliste hävitamine valke ja nende eraldamine lahusest fenooli ja kloroformi, DNA kontsentratsioon sademetest etanoolis.
geneetilist laborid sageli eraldatud DNA leukotsüüdid, mille puhul patsient võetakse 5-20 ml veeniverd steriilses toru valmistamine antikoagulandi( hepariin).Seejärel eraldatakse leukotsüüdid ja töödeldakse ülaltoodud etappe.
järgmisel ettevalmistustasemele materjali uuringut - DNA "cut" fragmentideks kohtades, kus on rangelt spetsiifilise alusjärjestusega juhtmes teostatakse bakteriaalsete ensüümide - restriktsioonendonukleaa( restriktaase).Restriktaasid tunnevad ära spetsiifilised järjestused 4-6, vähemalt 8-12 nukleotiidi viiakse kaheahelaline DNA molekuli ja selle lahutada fragmendid nende järjestuste lokaliseerida saite nimetatakse restriktsioonisaite. Saadud piiratud DNA fragmentide arv määratakse restriktsioonisaitide sageduse järgi ja fragmentide suurus määratakse nende alade jaotumise kaudu algse DNA molekuli pikkuse ulatuses. Mida sagedamini asuvad restriktsioonisaidid, seda lühemad on pärast piirangut DNA fragmendid. Praegu on teada rohkem kui 500 erinevat tüüpi bakteriaalse päritoluga restriktsiooniensüümi ja iga nendest ensüümidest on teada nukleotiidide spetsiifiline järjestus. Tulevikus võib restriktsioonisaite kasutada DNA geneetiliste markeritena. Saadud DNA restriktsioonifragmentidena võib järjestada pikkus elektroforeesil agaroos või polüakrüülamiidgeele ja seega võib määrata nende molekulmass. Tavaliselt avastamiseks DNA geelis kasutavad värvumist( tavaliselt etiidiumbromiidi) ja vaatamise geelist läbivas valguses ultraviolettkiirguse. DNA lokaliseerimise asukohad on punased. Kuid inimene töötlemisel mitut DNA restriktsioonendonukleaa moodustatud nii palju fragmendid erineva pikkusega, et nad ei saa lahutada elektroforeesil, siis ei ole võimalik visuaalselt kindlaks teha isiku DNA fragmentide elektrofore-gramm( toodetud ühtlase värvusega kogu pikkuses geel).Seetõttu kasutatakse sellises geelis soovitud DNA fragmentide identifitseerimiseks märgistatud DNA sondidega hübridisatsiooni meetodit.
Iga segment üheahelaline DNA või RNA on võimeline seonduma( hübridiseeruvad) oma komplementaarse ahela, guaniiniga on alati seotud tsütosiin, adeniin tümiiniga. See on kaheahelalise molekuli moodustumine. Kui kloonitud geeni üheahelaline koopia on märgistatud radioaktiivse märgistusega, saadakse sondi. Sond on võimeline leidma DNA komplementaarset segmenti, mida seejärel hõlpsalt tuvastada raadioautograafia abil. Radioaktiivset sondi lisatakse ravimi venitatud kromosoomid lahtrisse lokaliseerida geeni konkreetse kromosoomi DNA-ga sondi saab tuvastada teatavat portsjonit Southern blot. Hübridiseerumine tekib siis, kui DNA katseosa sisaldab normaalset geeni. Juhul kui on ebanormaalne nukleotiidide järjestus, st vastava kromosoomi struktuurid sisaldavad mutantgeeni ristamine ei esine, mis võimaldab määrata lokaliseerimine ebanormaalne geen.
DNA-sondide saamiseks kasutatakse geeni kloonimismeetodit. Sisuliselt meetod seisneb selles DNA fragmendid, mis tahes geeni või piirkonna geeni sisestatud kloonimise osakestena, tavaliselt bakteriaalse plasmiidi( ringikujuline ekstrakromosomaalsed DNA esineb bakterirakud ja veavad geene antibiootikumidele) ja seejärel bakteridmillel on sisseehitatud inimese
plasmiidgeen, korrutada. Tänu plasmiidi sünteesiprotsessidele on võimalik saada inimgeeni miljardeid eksemplare või selle saiti.
Radioaktiivse märgistusega või fluorokromiidiga märgistatud DNA täiendavaid koopiaid kasutatakse uuritavate DNA molekulide kogumi uurimiseks sondidena, et otsida täiendavaid järjestusi.
Praegu on geenimutatsioonide diagnoosimiseks mitmesuguseid meetodeid, kasutades DNA-sondid.