Μοριακές γενετικές μέθοδοι
μέθοδοι τεχνολογία DNA χρησιμοποιείται για να καθοριστεί ο εντοπισμός σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα του μεταλλαγμένου γονιδίου που είναι υπεύθυνο για την προέλευση ορισμένων μορφών κληρονομικές ασθένειες.Εφόσον το γονίδιο είναι ένα τμήμα DNA και γονιδιακής μετάλλαξης - ζημιά στην πρωτοταγή δομή του DNA( η μετάλλαξη είναι κατανοητό από όλες τις αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, ανεξάρτητα από τη θέση τους και την επίδραση στο άτομο βιωσιμότητα) τότε ιχνηλάτηση παρασκευάσματα των χρωμοσωμάτων μετάφασης ασθενή κληρονομική ασθένεια, είναι δυνατόν να διαπιστωθείεντοπισμός του παθολογικό γονίδιο.Μέθοδοι μοριακής γενετικής για να δημιουργήσει τη δυνατότητα διάγνωσης ασθενειών σε μια αλλαγμένη δομή του DNA, που επιτρέπουν να εξακριβωθεί ο εντοπισμός των κληρονομικών διαταραχών.Μοριακές γενετικές μεθόδους μπορεί να ανιχνεύσει μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντικατάσταση ακόμη και μίας βάσης.
πιο σημαντικό βήμα του προσδιορισμού γονιδίου - απομόνωση του.DNA μπορεί να απομονωθεί από οποιοδήποτε τύπο ιστού και των κυττάρων που περιέχουν πυρήνα.Τα βήματα της απομόνωσης DNA περιλαμβάνουν ταχεία λύση των κυττάρων με φυγοκέντρηση με αφαίρεση των θραυσμάτων των κυτταρικών οργανιδίων και μεμβράνες, ενζυματική καταστροφή των πρωτεϊνών και εκχύλιση τους από το διάλυμα με φαινόλη και χλωροφόρμιο, συγκέντρωση του DNA με καθίζηση σε αιθανόλη.
στη γενετική εργαστήρια συχνά DNA που απομονώνεται από λευκοκύτταρα, για την οποία έχει ληφθεί η ασθενής 5-20 ml φλεβικού αίματος σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα με ένα διάλυμα ενός αντιπηκτικού( ηπαρίνη).Στη συνέχεια, τα διαχωρισμένα λευκοκύτταρα και η επεξεργασία τους πραγματοποιείται σε στάδια που εκτίθενται παραπάνω.
επόμενο στάδιο της παρασκευής του υλικού με τη μελέτη - DNA «κοπεί» σε θραύσματα σε θέσεις με αυστηρά ειδική αλληλουχία βάσης εκτελείται μέσω των βακτηριακών ενζύμων - ενδονουκλεάσες περιορισμού( ένζυμα περιορισμού).Τα ένζυμα περιορισμού αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες του 4-6, τουλάχιστον 8-12 νουκλεοτίδια σε δίκλωνο μόριο DNA και διαχωρίζεται σε θραύσματα αυτών των αλληλουχιών εντοπίζεται θέσεις του κάλεσε θέσεις περιορισμού.Αριθμός παράγονται θραύσματα περιορισμού του DNA καθορίζεται από τη συχνότητα της εμφάνισης των θέσεων περιορισμού και τα θραύσματα του μεγέθους - τη φύση της κατανομής των εν λόγω θέσεις κατά μήκος του μήκους του αρχικού μορίου DNA.Οι περισσότερες θέσεις περιορισμού βρίσκεται, οι βραχύτερα θραύσματα DNA μετά την πέψη.Σήμερα υπάρχουν πάνω από 500 διαφορετικοί τύποι ενζύμων περιορισμού βακτηριακής προέλευσης, και καθένα από αυτά τα ενζύμου αναγνωρίζει ειδική αλληλουχία του νουκλεοτιδίων.θέσεις περιορισμού Στη συνέχεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες στο DNA.Τα προκύπτοντα τεμάχια διασπάσεως ϋΝΑ μπορούν να ταξινομηθούν ανά μήκος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου, και έτσι μπορεί να προσδιορισθεί το μοριακό βάρος τους.Συνήθως για την ανίχνευση του DNA στην πηκτή που χρησιμοποιείται από ειδική χρώση( συνήθως βρωμιούχο αιθίδιο) και την προβολή της γέλης σε μεταδιδόμενο φως του υπεριώδους.DNA εντοπισμού είναι κόκκινα.Ωστόσο, ένα πρόσωπο στην επεξεργασία πολλών περιορισμού DNA ενδονουκλεάσες σχηματίζεται τόσα πολλά θραύσματα διαφορετικών μηκών ότι αποτυγχάνουν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση, δεν είναι δυνατόν να εντοπιστούν οπτικά τα επιμέρους θραύσματα DNA για να elektrofore-γραμμάριο( παράγεται ομοιόμορφο χρωματισμό σε όλο το μήκος του πήγματος).Ως εκ τούτου, για τον εντοπισμό των σχετικών θραυσμάτων DNA σε ένα πήκτωμα με τη χρήση υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές DNA.
οποιοδήποτε τμήμα του μονόκλωνου DNA ή RNA είναι ικανό να δεσμεύεται( υβριδοποιούνται) με συμπληρωματική άλυσο του, με γουανίνη συνδέεται πάντα με κυτοσίνη, αδενίνη με τη θυμίνη.Από το σχηματισμό του διπλής έλικος μόριο.Αν ένα μονόκλωνο αντίγραφο ενός κλωνοποιημένου γονιδίου να ιχνηθέτηση μιας ραδιενεργούς σήμανσης, έναν ανιχνευτή.Ο ανιχνευτής ικανός ανακτήσει συμπληρωματικό τμήμα ϋΝΑ, το οποίο στη συνέχεια εύκολα αναγνωρίσιμα από αυτοραδιογραφία.Το ραδιενεργό ανιχνευτή προστίθεται στο φάρμακο τεντωμένο χρωμοσώματα επιτρέπει να εντοπιστεί το γονίδιο σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα με έναν ανιχνευτή DNA μπορεί να εντοπίσει ορισμένες μερίδες σε ένα στύπωμα Southern.Η υβριδοποίηση λαμβάνει χώρα όταν η περιοχή δοκιμής DNA περιέχει ένα φυσιολογικό γονίδιο.Στην περίπτωση όπου υπάρχει μια ανώμαλη αλληλουχία των νουκλεοτιδίων, δηλαδή οι αντίστοιχες δομές χρωμόσωμα περιέχουν ένα μεταλλαγμένο γονίδιο, υβριδισμός δεν θα συμβεί, η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό εντοπισμός του παθολογικό γονίδιο.
Για ανιχνευτές DNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γονιδιακής κλωνοποίησης.Η ουσία της μεθόδου συνίσταται στο ότι το θραύσμα DNA που αντιστοιχεί σε κάθε γονίδιο ή περιοχή του γονιδίου εισάγεται εντός του σωματιδίου κλωνοποίησης, συνήθως ένα βακτηριακό πλασμίδιο( κυκλικό εξωχρωμοσωματικό ϋΝΑ που υπάρχει σε βακτηριακά κύτταρα και που φέρουν γονίδια αντίστασης στα αντιβιοτικά), και στη συνέχεια τα βακτηρίδιαπου έχει ένα πλασμίδιο με ενσωματωμένο ανθρώπινη
γονίδιο, πολλαπλασιάζονται.Χάρη στις διεργασίες σύνθεσης στο πλασμίδιο, είναι δυνατόν να ληφθούν δισεκατομμύρια αντίγραφα του ανθρώπινου γονιδίου ή της θέσης του.
Περαιτέρω αντίγραφα του ϋΝΑ που έχει επισημανθεί με μια ραδιενεργή σήμανση ή φθοροχρώματα χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές για την αναζήτηση συμπληρωματικών αλληλουχιών μεταξύ των ομάδων μορίων ϋΝΑ που μελετήθηκαν.
Σήμερα, υπάρχουν πολλές ποικιλίες μεθόδων που χρησιμοποιούν ανιχνευτές DNA για τη διάγνωση γονιδιακών μεταλλάξεων.