Molekularne metody genetyczne
metod technologii DNA stosuje się w celu określenia lokalizacji na chromosomie danego zmutowanego genu odpowiedzialnego za pochodzenia niektórych postaciach chorób dziedzicznych. Ponieważ gen jest segmentem DNA i mutacja genu - uszkodzenie struktury pierwotnej DNA( mutacja jest zrozumiałe dla wszystkich zmian w sekwencji DNA, niezależnie od ich lokalizacji i wpływu na indywidualną żywotności), a następnie sondowania preparaty chromosomów metafazy pacjenta chorobą dziedziczną, możliwe ustalenielokalizacja patologicznego genu. Metody genetyki molekularnej, aby stworzyć możliwość diagnozowania chorób, w zmienionej strukturze DNA, pozwalają ustalić lokalizację zaburzenia dziedziczne. Molekularne metody genetyczne mogą ujawnić mutacje związane z zastąpieniem nawet jednej zasady.
Najważniejszym etapem identyfikacji genów jest jego izolacja. DNA można wyizolować z dowolnego typu tkanki i jąder zawierających komórki. Etapy izolacji DNA obejmują szybkiej lizy komórek za pomocą wirowania z usuwaniem fragmenty organelli komórkowych i błon, enzymatycznych niszczenie białek i ich ekstrakcji z roztworu fenolu i chloroformu, stężenie DNA przez wytrącenie etanolem.
w laboratoriach genetycznych często DNA wyizolowany z leukocytów, na które pacjent jest przenoszony 5-20 ml krwi żylnej w sterylnej probówce z roztworu antykoagulanta( heparyna).Leukocyty są następnie rozdzielane i przetwarzane zgodnie z etapami opisanymi powyżej.
Następny etap wytwarzania materiału do badania DNA - „cut” do fragmentów w miejscach, w ściśle określonej kolejności bazowej odbywa się za pomocą enzymów bakteryjnych - endonukleaz restrykcyjnych( enzymów restrykcyjnych).Enzymy restrykcyjne rozpoznawać specyficzne sekwencje 4-6, co najmniej 8-12 nukleotydów do cząsteczki DNA dwuniciowy i jego rozdzielone na fragmenty tych sekwencji zlokalizowanie miejsc zwanych miejscami restrykcyjnymi. Ilość wytwarzany Fragmenty restrykcyjne DNA zależy od częstotliwości występowania miejsc restrykcyjnych i fragmentów o wielkości: - rodzaj rozmieszczenia tych miejscach wzdłuż długości pierwotnej cząsteczki DNA.Im częściej miejsca restrykcyjne są zlokalizowane, tym krótsze fragmenty DNA po ograniczeniu. Obecnie znanych jest ponad 500 różnych rodzajów enzymów restrykcyjnych pochodzenia bakteryjnego, a każdy z tych enzymów rozpoznaje swoistą sekwencję nukleotydów. W przyszłości miejsca restrykcyjne mogą być wykorzystywane jako markery genetyczne dla DNA.Otrzymane fragmenty restrykcyjne DNA mogą być klasyfikowane pod względem długości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, a więc można określić ich masy cząsteczkowej. Zwykle do wykrycia DNA w żelu wykorzystywanego przez specyficzne barwienie bromkiem etydyny( zazwyczaj) i wyświetlania żel pod światło ultrafioletowe. Lokalizacje lokalizacji DNA mają czerwony kolor. Jednakże osoba przetwarzania wielu ograniczeń DNA endonukleazami utworzone tak wiele fragmentów o różnej długości, które nie będą one być rozdzielone przez elektroforezę, to nie jest możliwe, aby zidentyfikować wzrokowo jego fragmentów DNA do elektrofore-gram( wytworzonego jednolitego zabarwienia na całej długości żelu).Dlatego do identyfikacji pożądanych fragmentów DNA w takim żelu stosuje się metodę hybrydyzacji ze znakowanymi sondami DNA.
Każdy segment jednoniciowym DNA lub RNA ma zdolność wiązania( hybrydyzacji) z uzupełniającym łańcuchu guaniną jest zawsze związane z cytozyna, adenina tyminą.Jest to tworzenie dwuniciowej cząsteczki. Jeśli jednoniciowa kopia sklonowanego genu jest wyznakowana radioaktywnym znacznikiem, uzyskana zostanie sonda. Sonda jest w stanie znaleźć komplementarny segment DNA, który jest następnie łatwo identyfikowany za pomocą radiografii. Sonda radioaktywna dodaje się do leku rozciągnięty chromosomów pozwala zlokalizować gen dla określonego chromosomu z sondą DNA może zidentyfikować określone części, w Southern blot. Hybrydyzacja występuje, jeśli część testowa DNA zawiera normalny gen. W przypadku, gdy nie jest normalną sekwencję nukleotydów, to odpowiednie struktury chromosomów zawierają zmutowany gen hybrydyzacja nie występuje, co pozwala na określenie lokalizacji nieprawidłowego genu.
Aby uzyskać sondy DNA, stosuje się metodę klonowania genów. Istota sposobu polega na tym, że fragment DNA odpowiadający genu lub regionu genu wstawionego do cząstki klonowania, zwykle plazmid bakteryjny( kołowym pozachromosomalny DNA obecnego w komórkach bakteryjnych i przenoszenia genów oporności na antybiotyki) i bakteriio plazmidzie z wbudowanym ludzkim
Gen, rozmnażaj się.Dzięki procesom syntezy w plazmidzie możliwe jest uzyskanie miliardów kopii ludzkiego genu lub jego miejsca.
Dalsze kopie DNA znakowanego radioaktywnym znacznikiem lub fluorochromami są używane jako sondy do wyszukiwania sekwencji komplementarnych w puli badanych cząsteczek DNA.
Obecnie istnieje wiele odmian metod wykorzystujących sondy DNA do diagnozy mutacji genowych.