Molekulārās ģenētiskās metodes
DNS tehnoloģiju metodes tiek izmantotas, lai noteiktu lokalizāciju konkrētā hromosomā mutanta gēna, kas atbild par izcelsmes noteikta veida iedzimtām slimībām. Tā kā gēns ir DNS segmentu un gēnu mutāciju - bojājumi primāro struktūru DNS( mutācijas saprot visas izmaiņas DNS secības, neatkarīgi no to atrašanās vietas un ietekmi uz atsevišķu dzīvotspēju), tad zondēšana preparāti metafāze pacientu hromosomas iedzimta slimība, iespējams izveidotpatoloģiskā gēna lokalizācija. Metodes molekulārās ģenētikas, lai radītu iespēju slimības diagnosticēt pie izmainītā DNS struktūru, tie ļauj noskaidrot lokalizāciju iedzimtiem traucējumiem. Molekulārās ģenētiskās metodes var atklāt mutācijas, kas saistītas ar pat vienas bāzes nomaiņu.
Vissvarīgākais gēnu identifikācijas posms ir tā izolācija. DNS var izolēt no jebkāda veida audiem un šūnām, kas satur kodolus. Ar DNS izolācijas soļi ietver ātru šūnas lizējot centrifugējot noņemot fragmentiem šūnu organellās un membrānām, fermentatīvo iznīcināšanu proteīniem un to iegūšanu no šķīduma ar fenola un hloroformu, DNS koncentrāciju ar nogulsnēšanu etanolā.
ģenētiskās laboratorijas bieži DNS izolēta no leikocītu, par kuru pacients tiek veikti 5-20 ml venozo asiņu sterilā mēģenē ar šķīdumu, antikoagulanta( heparīna).Pēc tam leikocītus atdala un apstrādā saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem posmiem.
nākamais posms no sagatavošanas materiāla uz mācību - DNS "cut" fragmentos vietās, kurās ir stingri īpašu bāžu secību, kas tiek veikta, izmantojot baktēriju enzīmu - ierobežojumu endonucleases( restrikcijas enzīmu).Restrikcijas fermenti atpazīt īpašas secības 4-6, vismaz 8-12 nukleotīdus uz divpavedienu DNS molekulas un tās kas ir sadalīts fragmentos Šo sekvenču lokalizētu vietām, ko sauc par restrikcijas vietas. Number ražots restrikcijas fragmentu DNS nosaka biežumu rašanos restrikcijas vietu un fragmenti lieluma - dabu šajās vietās gar sākotnējā DNS molekulas sadalījumu. Jo biežāk atrodas ierobežošanas vietnes, jo īsāki ir DNS fragmenti pēc ierobežojuma. Pašlaik ir vairāk nekā 500 dažāda veida restrikcijas enzīmu baktēriju izcelsmes, un katrs no šiem fermenta atzīst savu īpašo nukleotīdu sekvenci. Nākotnē restrikcijas vietnes var izmantot kā DNS ģenētiskos marķierus. Iegūtie DNS restrikcijas fragmenti var tikt sakārtoti pēc garuma ar elektroforēzi agarozes vai poliakrilamīdu gēli, un līdz ar to var noteikt to molekulmasa. Parasti, lai noteiktu DNS gela ar īpatnējo iekrāsošanai izmanto( parasti etīdija bromīda) un apskatot gelu pārraida gaismas ultravioleto starojumu. DNS lokalizācijas vietām ir sarkana krāsa. Tomēr personai, kas no vairākiem DNS ierobežojuma apstrādes endonucleases veidojas tik daudzas fragmenti no dažāda garuma, ka viņi nespēj jāatdala ar elektroforēzes, tas nav iespējams vizuāli identificēt atsevišķus DNS fragmenti elektrofore-gramu( ražots vienotu krāsojumu visā garumā želeju).Tāpēc, lai noteiktu attiecīgos DNS fragmentus ar želeju, izmantojot hibridizāciju ar iezīmētām DNS zondes.
Jebkurš segments vienu DNS vai RNS ir spējīgs saistīties( krustoties) ar tās papildu ķēdi, ar guanīna vienmēr ir saistīta ar citozīnu, adenīna ar timīna. Tas ir divšķautņu molekulas veidošanās. Ja vienpavediena kopiju klonētas gēna tag radioaktīvo etiķete, zondi. Zondes spēj atrast papildu DNS segmentu, ko pēc tam viegli identificē ar radioautogrāfiju. Radioaktīvais zonde tiek pievienots narkotiku izstiepts hromosomas ļauj, lai lokalizētu gēnu ar īpašu hromosomas ar kādu no DNS zondi var identificēt atsevišķas porcijas tādā Southern blot. Hibridizācija notiek, ja DNS pārbaudes daļā ir normāls gēns. Gadījumā, ja ir patoloģiska nukleotīdu secību, t.i. atbilstošie hromosomu struktūras satur mutācijas gēnu nenotiks hibridizācija, kas ļauj noteikt lokalizāciju patoloģisku gēnu.
Lai iegūtu DNS zondes, tiek izmantota gēnu klonēšanas metode. Metodes būtība veido ar to, ka DNS fragments, kas atbilst jebkurai gēnu vai reģionā gēna ievietota klonēšanas daļiņas, kas parasti ir baktēriju plazmīdas( apļveida atdalīto DNS, kas atrodas baktēriju šūnām un veiktu rezistences gēnus pret antibiotikām), un pēc tam baktērijasar plazmīdu ar iebūvētu cilvēka
gēns, vairoties. Pateicoties sintēzes procesiem plazmīdā, ir iespējams iegūt miljardos cilvēka gēna eksemplāru vai tā vietu.
Papildu DNS marķējums, kas marķēts ar radioaktīvo etiķeti vai fluorohromiem, tiek izmantots kā zondes, lai meklētu komplementārās sekvences pētīto DNS molekulu kopumā.
Pašlaik ir daudz dažādu metožu, izmantojot DNS zondes, lai noteiktu gēnu mutācijas.