Métodos genéticos moleculares
se utilizan para determinar la localización en un cromosoma particular del gen mutante responsable del origen de ciertas formas de enfermedades hereditarias. Dado que el gen es un segmento de ADN y la mutación de genes - daños a la estructura primaria del ADN( una mutación es entendido por todos los cambios en la secuencia de ADN, independientemente de su ubicación y la influencia sobre la viabilidad individuo) enfermedad luego sondeo preparaciones de cromosomas de pacientes metafase heredan, posible establecerlocalización del gen patológicoLos métodos de la genética molecular para crear la posibilidad de diagnosticar enfermedades en una estructura de ADN alterada, que permiten determinar la localización de trastornos hereditarios. Los métodos genéticos moleculares pueden revelar mutaciones asociadas con el reemplazo de incluso una única base.
La etapa más importante de la identificación de genes es su aislamiento. El ADN se puede aislar de cualquier tipo de tejido y núcleos que contengan células. Las etapas de aislamiento de ADN incluyen la lisis rápida de las células por centrifugación con la eliminación de fragmentos de orgánulos y membranas celulares, la destrucción enzimática de las proteínas y su extracción a partir de la solución con fenol y cloroformo, la concentración de ADN por precipitación en etanol.
en laboratorios de genética a menudo ADN aislado a partir de leucocitos, para lo cual se toma el paciente 5-20 ml de sangre venosa en un tubo estéril con una solución de un anticoagulante( heparina).Los leucocitos se separan y procesan de acuerdo con los pasos descritos anteriormente.
siguiente etapa de preparación del material para el estudio - DNA "corte" en fragmentos en sitios con secuencia de bases estrictamente específica se realiza por medio de enzimas bacterianas - endonucleasas de restricción( enzimas de restricción).Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de 4-6, por lo menos 8-12 nucleótidos en la molécula de ADN de doble cadena y sus separados en fragmentos de estas secuencias de localizar sitios llamados sitios de restricción. Número producido fragmentos de restricción del ADN determinada por la frecuencia de ocurrencia de sitios de restricción y los fragmentos de tamaño - la naturaleza de la distribución de estos sitios a lo largo de la longitud de la molécula de ADN original. Cuanto más a menudo se encuentren los sitios de restricción, más cortos serán los fragmentos de ADN después de la restricción. Actualmente hay más de 500 tipos diferentes de enzimas de restricción de origen bacteriano, y cada uno de estos enzima reconoce su secuencia específica de nucleótidos. En el futuro, los sitios de restricción se pueden usar como marcadores genéticos para el ADN.Los fragmentos de restricción de ADN resultantes se pueden ordenar por longitud por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida, y por lo tanto se pueden determinar su peso molecular. Por lo general, para la detección de ADN en el gel utilizado por tinción específica( bromuro de etidio por lo general) y ver el gel en luz transmitida el ultravioleta. Las ubicaciones de localización de ADN tienen un color rojo. Sin embargo, una persona en el procesamiento de varios de restricción de ADN endonucleasas formado tantos fragmentos de diferentes longitudes que son capaces de ser separados por electroforesis, no es posible identificar visualmente los fragmentos de ADN individuales para elektrofore-gramo( coloración uniforme producido a lo largo de la longitud del gel).Por lo tanto, se usa un método de hibridación con sondas de ADN marcadas para identificar los fragmentos de ADN deseados en dicho gel.
cualquier segmento de ADN monocatenario o ARN es capaz de unirse( hibridar) con su cadena complementaria, con la guanina siempre está asociado con citosina, adenina con timina. Esta es la formación de una molécula de doble cadena. Si una copia monocatenaria del gen clonado se etiqueta con una etiqueta radioactiva, se obtendrá una sonda. La sonda es capaz de encontrar un segmento complementario de ADN, que luego se identifica fácilmente por radioautografía. Se añade la sonda radioactiva a los cromosomas estirado de drogas permite localizar el gen a un cromosoma particular con una sonda de ADN puede identificar ciertas porciones en una transferencia de Southern. La hibridación ocurre si la porción de prueba del ADN contiene un gen normal. En el caso donde hay una secuencia anormal de nucleótidos, es decir, las estructuras cromosómicas correspondientes contienen un gen mutante, no ocurre la hibridación, que permite determinar la localización del gen anormal.
Para obtener sondas de ADN, se usa el método de clonación de genes. La esencia del método consiste en que el fragmento de ADN correspondiente a cualquier gen o región del gen insertado en la partícula de clonación, normalmente un plásmido bacteriano( ADN circular extracromosómico presente en las células bacterianas y que lleva los genes de resistencia a los antibióticos), y luego las bacteriastener un plásmido con un
humano incorporadoGen, multiplicarGracias a los procesos de síntesis en el plásmido, es posible obtener miles de millones de copias del gen humano o de su sitio.
Se usan más copias de ADN marcado con una etiqueta radioactiva o fluorocromos como sondas para buscar secuencias complementarias entre el conjunto de moléculas de ADN estudiadas.
Actualmente, existen muchas variedades de métodos que utilizan sondas de ADN para el diagnóstico de mutaciones genéticas.